Fonctions et régulations de la polo kinase Cdc5 dans l'adaptation aux dommages à l'ADN chez Saccharomyces cerevisiae

Coordination of the cell cycle and DNA damage checkpoint in adaptation to DNA damage

• Auteur / Autrice : Jeanne Le Peillet
• Direction : Zhou Xu
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Génétique et génomique
• Date : Soutenance le 27/10/2022
• Etablissement(s) : Sorbonne université
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Complexité du vivant (Paris ; 2009-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Biologie computationnelle et quantitative (Paris ; 2011-....)
• Jury : Président / Présidente : Pascale Lesage
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Claire Torchet
• Jury : Rapporteur / Rapporteuse : Pascale Lesage, Gérard Mazón

Mots clés

Mots clés contrôlés

Génomique

Sérine / thréonine kinases

Saccharomyces cerevisiae

ADN -- Altération

Mots clés libres

Cdc5

Dommages à l'ADN

Adaptation

Cdc5

DNA damage

Adaptation

Résumé

Les dommages à l'ADN constituent une grave menace pour l'intégrité du génome. Lorsque l'ADN d'une cellule est endommagé, le point de contrôle des dommages à l'ADN les détecte et arrête le cycle cellulaire, laissant ainsi du temps pendant lequel la cellule peut réparer son ADN. Toutefois, si les dommages ne sont pas réparés après plusieurs heures, chez la levure Saccharomyces cerevisiae, les cellules finissent par reprendre leur cycle cellulaire malgré la persistance du dommage. Ce processus, appelé adaptation aux dommages de l'ADN, semble agir comme une dernière tentative de survie des cellules, bien qu'il favorise les mutations et l'instabilité génomique dans les cellules filles. Chez Saccharomyces cerevisiae, la polo-kinase Cdc5PLK1, impliquée par ailleurs dans de nombreux processus liés au cycle cellulaire, est critique pour l'adaptation. Cependant, ses cibles spécifiques de l'adaptation ne sont pas encore clairement définies, et son rôle exact dans ce processus reste incertain. Ces travaux de thèse font état de nos avancées sur les régulations transcriptionnelles et post-traductionnelles de Cdc5 en réponse à un dommage à l’ADN de type déstabilisation télomérique. En particulier, nous sommes parvenus à identifier des résidus de Cdc5 dont la phosphorylation module l’efficacité de l’adaptation et avons mis en évidence que le checkpoint de dommages à l’ADN provoque une régulation négative de l’expression de Cdc5 via l’action de Mec1, Rad53 et Ndd1, retardant l’adaptation. Ces travaux ont mené à la rédaction d’un article déposé sur bioRxiv et en cours de soumission. Par ailleurs, Cdc5 cible de nombreux substrats au cours d’un cycle cellulaire normal. Identifier les substrats spécifiques de l’adaptation permettrait de comprendre son rôle au sein de ce processus. Nous avons entrepris un crible à grande échelle en utilisant une méthode basée sur l’insertion aléatoire d’un transposon dans le génome entier et de façon unique (Saturated Analyses Transposons Assay in Yeast). De ce crible sont ressortis un certain nombre de gènes potentiellement impliqués dans l’adaptation et que nous avons analysé, à la fois à une échelle globale par Gene Ontology, et à une échelle assez fine, en repérant les gènes enrichis et en s’intéressant particulièrement aux gènes inclus dans un même complexe afin de gagner en robustesse. Dans les trois expériences indépendantes menées pour ce crible, nous voyons ressortir un certain nombre de complexes, notamment MRX, qui est impliqué dans les voies de réparation de l’ADN, la gestion du stress réplicatif et qui participe à l’activation du checkpoint de dommages à l’ADN. En plus des analyses bio-informatiques, l’implication potentielle des gènes du complexe MRX a été testée expérimentalement. Cdc5 joue un rôle essentiel dans l’adaptation au dommage à l’ADN, mais son rôle dans ce processus reste mal défini. Nous avons mis en évidence que Cdc5 est fortement phosphorylée et que ses sites de phosphorylation régulent l’efficacité de l’adaptation, et est aussi régulée au niveau de sa quantité. D’autre part, nous avons réalisé une caractérisation approfondie des gènes candidats détectés par nos cribles, ce qui aide à révéler les mécanismes moléculaires de l’adaptation.

DNA damage is a serious threat to genome integrity. When a cell's DNA is damaged, the DNA damage checkpoint detects it and stops the cell cycle, allowing time for the cell to repair its DNA. However, if the damage is not repaired after several hours, in the yeast Saccharomyces cerevisiae, the cells eventually resume their cell cycle despite the persistence of the damage. This process, called adaptation to DNA damage, appears to act as a last-ditch attempt at cell survival, although it promotes mutations and genomic instability in the daughter cells. In Saccharomyces cerevisiae, the Cdc5PLK1 polo-kinase, otherwise involved in many cell cycle-related processes, is critical for adaptation. However, its specific targets in adaptation are not yet clearly defined, and its exact role in this process remains unclear. In this thesis, we report on the transcriptional and post-translational regulation of Cdc5 in response to telomere destabilization-type DNA damage. In particular, we identified Cdc5 residues whose phosphorylation modulates adaptation efficiency and demonstrated that the DNA damage checkpoint down-regulates Cdc5 expression via the action of Mec1, Rad53 and Ndd1, delaying adaptation. This work has led to the writing of a paper filed on bioRxiv and currently being submitted. Moreover, Cdc5 targets many substrates during a normal cell cycle. Identifying the specific substrates of adaptation would help to understand its role in this process. We undertook a large-scale screen using a method based on random insertion of a transposon in the whole genome in a unique way (Saturated Analyses Transposons Assay in Yeast). From this screen, a certain number of genes potentially involved in adaptation emerged and we analyzed them, both on a global scale using Gene Ontology, and on a fairly fine scale, by identifying enriched genes and by focusing on genes included in the same complex in order to gain robustness. In the three independent experiments conducted for this screen, we see a number of complexes stand out, notably MRX, which is involved in DNA repair pathways, replicative stress management and participates in DNA damage checkpoint activation. In addition to the bioinformatics analyses, the potential involvement of the MRX complex genes was tested experimentally. Cdc5 plays an essential role in adaptation to DNA damage, but its role in this process remains poorly defined. We have shown that Cdc5 is highly phosphorylated and that its phosphorylation sites regulate the efficiency of the adaptation, and is also regulated in its quantity. On the other hand, we performed an extensive characterization of the candidate genes detected by our screens, which helps to reveal the molecular mechanisms of adaptation.