Transient CRISPR-Cas delivery for therapeutic gene editing in the retina
Transfert transitoire de CRISPR‐Cas pour l'édition de gène dans la rétine
Résumé
Genome editing mediated by CRISPR-Cas has shown promise for the treatment of retinal dystrophies (RD). Currently, adeno-associated viruses are the most widely used vectors for retinal gene therapies but their small packaging capacity and permanent transgene expression makes them suboptimal for CRISPR-Cas delivery. Transient delivery of Cas9 protein and its gRNA as ribonucleoprotein (RNP) complexes have been reported in the retinal pigment epithelium (RPE) and into the inner ear cells in vivo. We investigate transient delivery of Cas RNP into photoreceptors as these are the target cells for most prevalent inherited RD. Subretinal injection of Cas9 RNP generated indels in the neural retina in a dose dependent manner. Targeting VEGFa gene, the indels reach 0.4% in the whole neural retina compared to 1.4% in the RPE. To improve delivery, we investigated different categories of non-viral vectors such as cationic lipids and cell penetrating peptides (CPP). These synthetic carriers increased Cas9 RNPs delivery to the RPE but not in the neural retina. RNP complexes showed accumulation above the tightly stacked outer segments pointing to physical barriers to neural retina infiltration. Delivery in mice lacking outer segments did not improve indel frequency suggesting other barriers such as the accessibility of the target gene and DNA repair mechanisms in degenerating photoreceptors are at play. Indeed, changing the target locus from VEGFa to SAG, a gene highly expressed in photoreceptors, improved significantly indel frequencies reaching 7%. Our results highlight the need to develop new carrier compounds and use suitable model systems for validation of gene editing interventions.
L'édition du gène par CRISPR-Cas s'est révélée prometteuse pour le traitement des dystrophies rétiniennes (DR). L'administration transitoire de la protéine Cas9 et son ARNg sous forme de complexes ribonucléoprotéiques (Cas9 RNP) a déjà montré un transfert efficace à l'épithélium pigmentaire rétinien (EPR) et dans les cellules de l'oreille interne in vivo. Ici, nous avons étudié le transfert direct de Cas9 sous forme d'ARNm ou de RNP dans les photorécepteurs qui sont les cibles principales dans les DR héréditaires. Contrairement à l'ARNm, l'injection sous-rétinienne de Cas9 RNP a généré des indels dans la rétine neurale de manière dose-dépendante. Pour améliorer le transfert des RNPs, nous avons étudié différentes catégories de vecteurs non viraux tels que les lipides cationiques et les peptides. Ces transporteurs synthétiques ont augmenté leur transfert dans l’EPR uniquement. Les complexes RNPs ont montré une accumulation au dessus des segments externes indiquant des barrières physiques empêchant l'infiltration des RNPs dans la rétine. L'administration chez des souris dépourvues de segments externes n'a pas amélioré la fréquence des indels, ce qui suggère que d'autres barrières telles que l'accessibilité du gène et les mécanismes de réparation de l'ADN dans les photorécepteurs en dégénérescence sont en jeu. En effet, le changement du locus ciblé a permis d’améliorer la fréquence des indels de manière significative, atteignant 7% et entraînant une diminution du niveau de l'ARNm pour le gène SAG. Nos résultats mettent en évidence la nécessité de développer de nouveaux vecteurs et d'utiliser des modèles appropriés pour la validation des thérapies d’édition du génome.
Origine : Version validée par le jury (STAR)