Modélisation de la maladie de Parkinson à l’aide de cellules souches pluripotentes induites dérivées de patients

Modelling Parkinson's disease with patient induced pluripotent stem cells

• Auteur / Autrice : Nabila Pyrenina Thamrin
• Direction : Afsaneh Gaillard, Sébastien Brot
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Neurosciences
• Date : Soutenance le 10/03/2022
• Etablissement(s) : Poitiers
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Sciences Biologiques et Santé (Limoges ; 2018-2022)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Laboratoire de neurosciences expérimentales et cliniques - LNEC (Poitiers ; 2012-....)
• Partenaire(s) de recherche : faculte : Université de Poitiers. UFR des sciences fondamentales et appliquées
• Jury : Président / Présidente : Pierre-Olivier Fernagut
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Afsaneh Gaillard, Sébastien Brot
• Jury : Rapporteur / Rapporteuse : Sylvie Chalon, Isabelle Cloëz-Tayarani

Mots clés

Mots clés contrôlés

Mutation (biologie)

Gène PARK 2

Transplantation

Modèles mathématiques

Maladie de Parkinson

Mots clés libres

Maladie de Parkinson

Mutation de parkine

Cellules souches pluripotentes induites

Neurones dopaminergiques

Transplantation

Parkinson's disease

Parkin mutation

Induced-Pluripotent stem cells

Dopaminergic neurons

Transplantation

Résumé

La maladie de Parkinson (MP) est la deuxième maladie neurodégénérative motrice liée à l'âge qui touche près de 1% de la population de plus de 60 ans, caractérisée par une perte progressive des neurones dopaminergiques (DA) dans la substance noire. La majorité des cas de la MP sont sporadiques, cependant, 5 à 10 % des cas sont liés à des mutations au niveau de gènes spécifiques et sont alors qualifiés de forme familiale. Des mutations de la protéine parkine sont la cause génétique la plus courante de la forme familiale de la MP. L'absence d’une compréhension claire de la manière dont cette mutation provoque la MP entrave le développement de thérapies curatives de la maladie. La découverte des cellules souches pluripotentes induites (CSPi) permet de générer des neurones dopaminergiques (DA) spécifiques aux patients afin d'étudier comment la mutation de parkine cause la MP.Les objectifs de cette étude sont d'obtenir des CSPi à partir de fibroblastes dermiques de patients présentant différentes mutations de parkine et de sujets normaux comme contrôle, de générer des neurones DA à partir de CSPi spécifiques de patients, et d'étudier in vitro et in vivo l'impact de la mutation de parkine sur la survie, la maturation et le dysfonctionnement mitochondrial des neurones DA.Nous avons utilisé des fibroblastes dermiques humains transfectés avec un plasmide codant pour les facteurs de Yamanaka (Oct4, Klf4, Sox2 et c-Myc), afin de les reprogrammer en CSPi. A partir de ces CSPi, nous avons obtenu des neurones DA en passant par une différenciation de cellules de la plaque du plancher. Dans un premier temps, nous avons étudié l'impact des mutations de parkine in vitro sur la survie cellulaire, la différenciation, la maturation et la fonction mitochondriale de neurones DA dérivés de patients présentant une mutation de parkine et de sujets témoins. Après différenciation, plus de 70% des cellules générées expriment des marqueurs de précurseurs de DA tels que FOXA2, OTX2 & LMX1A chez les deux types de sujets. Cependant, nous avons observé une réduction importante du nombre de cellules exprimant les marqueurs DA matures, lorsqu’elles sont dérivées de patients atteint de la mutation de parkine.L’altération mitochondriale a été analysée en utilisant l'anticorps Cytochrome-C et un marqueur de potentiel de membrane : MitoTracker. Au stade de précurseur de DA, environ 80% des mitochondries étaient métaboliquement actives chez les deux sujets. Cependant, au stade de la maturation, nous avons observé une diminution de 15-25% de l'activité mitochondriale dans les cellules du patient présentant une mutation de parkine. La détection de l'apoptose à l'aide du test TUNEL ou de l'annexin-V a montré une apoptose 20% plus élevée dans les cellules du patient.Dans un deuxième temps, nous avons transplanté des précurseurs de DA dérivés de patients et de témoins dans la substantia nigra d'un modèle murin de la MP. Un mois après la greffe, nous avons trouvé une réduction de 5 fois du nombre de neurones matures DA dans les greffes de cellules issus d’un patient par rapport au contrôle. Cette approche nous a permis d’étudier des résultats à plus long terme qu’in vitro. De façon intéressante, il n'y avait pas de différence entre les deux sujets en ce qui concerne la prolifération cellulaire et la maturation neuronale.Nos résultats indiquent que la mutation de parkine induit à une accumulation de mitochondries défectueuses conduisant à la mort cellulaire, en particulier dans les neurones DA. Nous avons montré que la combinaison de neurones DA dérivés de patients de la MP avec mutation de parkine et la transplantation permettrait d'étudier les conséquences à long terme de la mutation sur le développement des neurones DA.

Parkinson’s disease (PD) is the second most common age-related motoric neurodegenerative disease affects nearly 1% of the population above the age of 60, characterized by progressive loss of dopaminergic (DA) neurons in the substantia nigra. The majority of PD cases are sporadic however, 5-10% of cases are related to mutations in particular genes and are referred to familial form. Mutations in PARKIN are the most common genetic cause for familial PD. The lack of a clear understanding on how this mutation causes PD hampers the development of disease-modifying therapies. The discovery of Induced pluripotent stem cells (iPSCs) makes it possible to generate patient-specific dopaminergic (DA) neurons to study how PARKIN mutation causes PD.The aims of this study are to obtain the iPSCs from patient’s dermal fibroblasts with different parkin mutations and normal subject as control, to generate DA neurons from patient-specific iPSCs, and to study in vitro and in vivo the impact of PARKIN mutation on the survival, maturation and mitochondrial dysfunction of DA neurons.We used human dermal fibroblasts transfected with Yamanaka plasmid (vector encoding Oct4, Klf4, Sox2 and c-Myc) to reprogram into iPSCs. With this iPSC, we obtained DA neurons by differentiating with floor-plate cells-based differentiation. In a first step, we have investigated the impact of PARKIN mutations in vitro on cell survival, differentiation, maturation and mitochondrial function of DA neurons derived patient with PARKIN mutation and control subjects. After differentiation, more than 70% of the generated cells expressed DA precursor markers such as FOXA2, OTX2 & LMX1A in both subjects. However, there is an important reduction in the number of cells expressing mature DA markers in patient with PARKIN mutation.The mitochondrial health has been analyzed by using Cytochrome-C antibody and a membrane potential marker: MitoTracker. At DA precursor stage, around 80% of mitochondria were metabolically actives in both subjects. However, at maturation stage, we observed a 15-25% decrease in mitochondrial activity in patient cells with PARKIN mutation. Apoptosis detection using TUNEL or annexin-V assay showed 20% higher apoptosis in patient cells.In a second step, we transplanted DA precursors derived patients and control into the substantia nigra in a mouse model of PD. One month after grafting, we found a 5-fold reduction in the number of DA neurons in grafts from patient cells compared to control, give the results at long term. Interestingly, there was no difference between cell proliferation and neuronal maturation between both subjects.Our results show that the PARKIN mutation induces mitochondrial dysfunction leading to cell death, particularly in DA neurons. We have shown that the combination of DA neurons derived from PD patient with PARKIN mutation and transplantation allows us to study the long-term consequences of the mutation on the development of DA neurons.