Apport de l'ADN circulant tumoral dans les cancers digestifs

Contribution of circulating tumor DNA in digestive cancers

• Auteur / Autrice : Camille Evrard
• Direction : Lucie Karayan-Tapon, David Tougeron
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Aspects moléculaires et cellulaires de la Biologie
• Date : Soutenance le 13/12/2022
• Etablissement(s) : Poitiers
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Rosalind Franklin (Poitiers ; 2022-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Progression et dissémination cérébrales des cellules tumorales (Poitiers ; 2022-....)
• Partenaire(s) de recherche : faculte : Université de Poitiers. UFR de médecine et de pharmacie
• Jury : Président / Présidente : Frédéric Di Fiore
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Julien Edeline
• Jury : Rapporteur / Rapporteuse : Jean-Baptiste Bachet, Catherine Alix-Panabieres

Mots clés

Mots clés contrôlés

Cancer colorectal

PCR digitale

Cancer

Pancréas

ADN tumoral circulant

Instabilité des microsatellites

Mots clés libres

ADN circulant tumoral

Cancer pancréatique

Cancer colique avec instabilité microsatellitaire

PCR digital

Séquençage haut débit

Circulating tumor DNA

Pancreatic cancer

Colorectal cancer with microsatellite instability

Digital PCR

Next generation sequencing

Résumé

La cancérologie est une spécialité en constante évolution avec le développement de la médecine personnalisée, ce qui nécessite de définir des biomarqueurs pronostiques et/ou prédictifs fiables et reproductibles de réponse à un traitement donné. Actuellement la recherche d’anomalies moléculaires se fait quasi exclusivement au niveau tumoral, or il est maintenant connu que les tumeurs relarguent de l’ADN circulant tumoral (ADNct), « dilué » dans l’ADN total (ADN cell free (ADNcf)). Aujourd’hui seules quelques indications d’analyses sur ADNct sont validées et remboursées en raison de conditions pré-analytiques et de techniques d’analyses très hétérogènes. Dans le cadre de ma Thèse de Sciences j’ai évalué l’ADNct comme biomarqueur prédictif dans les adénocarcinomes pancréatiques (AP) et pour le diagnostic et le suivi de l’instabilité microsatellitaire (MSI) dans les cancers colorectaux (CCR). Mon premier travail porte sur l’étude de l’ADNct et de l’ADNcf comme marqueur prédictif de réponse à la chimiothérapie (CT) de 1ère ligne chez les patients atteints d’un adénocarcinome pancréatique (AP) non résécable (étude KRASCIPANC). Pour ce cancer de mauvais pronostic, il est urgent de trouver un biomarqueur prédictif de réponse à la CT. Dans ce travail incluant 69 patients j’ai définis un score combiné associant ADNcf initial et ADNct muté KRAS à J28, hautement prédictif de réponse au traitement. Ce score combiné nécessite d’être validé sur une cohorte plus large pour ensuite développer une étude prospective de phase II avec changement précoce de CT guidé par l’ADNct. Dans la deuxième partie de ma Thèse je me suis intéressée aux cancers colorectaux avec une instabilité microsatellitaire (CCR MSI) dont la prise en charge thérapeutique est en pleine révolution avec l’efficacité majeure de l’immunothérapie (IO) dont la prescription est sous-tendue par la détermination du phénotype MSI. La réalisation de cette analyse par la technique de séquençage haut débit (Next Generation Sequencing, NGS) est importante afin de pouvoir la réaliser dans une approche « tout en un » en concomitance avec la recherche de mutation des gènes d’intérêt. Nous avons sélectionné puis testé en NGS un octaplex de microsatellites (CaBio) avec le pipeline bio-informatique MSI Detection (MSID) sur 391 tumeurs en se comparant aux 2 techniques de référence. Nous avons ainsi mis en place un test de phénotypage de MSI en NGS, l’octaplex CaBio-MSID, qui a une sensibilité de 98,4% et une spécificité de 98,4% pour les CCR.Enfin le troisième travail présenté est encore en cours et utilise l’octaplex CaBio-MSID et l’analyse en ddPCR des microsatellites du Pentaplex sur ADNct dans une population prise en charge pour un CCR MSI. Les résultats préliminaires portant sur 80 prélèvements de 31 patients ont permis de retrouver une sensibilité et une spécificité de la ddPCR-MSI respectivement de 100% et 81,8%, ces valeurs étaient de 90,9% et 100% pour la technique CaBio-MSID. La quantité d’instabilité reflétée par la fréquence allélique de MONO-27 instable semble corrélée à la réponse tumorale avec 79,2% d’ADNct-MSI détecté en ddPCR dans le groupe de patients en progression tumorale contre 50% avec la technique octaplex CaBio-MSID. Ces résultats sont à interpréter avec précautions en raison de leur caractère préliminaire, de la population faible et de plusieurs biais techniques. Ces travaux confirment l’intérêt clinique de l’ADNct dans les cancers digestifs pour déterminer en amont des évaluations radiologiques standards la réponse au traitement. Malgré les progrès des techniques de biologie moléculaire, la principale limite des travaux sur l’ADNct reste la sensibilité de détection qui mérite d’être améliorée avec également la nécessité de standardiser les techniques d’analyses sur de larges séries. Plus important encore il faut démontrer l’impact clinique de l’ADNct dans des essais prospectifs randomisés d’adaptation thérapeutique en fonction de la cinétique de l’ADNct.

Oncology is a constantly evolving specialty with the development of personalized medicine, which requires the development of reliable and reproducible prognostic and/or predictive biomarkers of response to a given treatment.Currently, the search for molecular abnormalities is done almost exclusively on tumor, but it is now known that tumors release tumor circulating DNA (ctDNA), ''diluted'' in total DNA (cell free DNA (cfDNA)). Blood fluid biopsy is simple, easy to repeat and overcomes tumor heterogeneity. Today, only a few indications for ctDNA analyzes are validated and reimbursed due to very heterogeneous pre-analytical conditions and analysis techniques.As part of my Thesis, I evaluated ctDNA as a predictive biomarker in pancreatic adenocarcinoma (PA) and for the diagnosis and monitoring of microsatellite instability (MSI) in colorectal cancer (CRC).The first step concerns the study of ctDNA and cfDNA as predictive marker of response to 1st line chemotherapy (CT) in patients with unresectable PA (KRASCIPANC study). For this cancer with a poor prognosis, it is urgent to find a predictive biomarker of response to CT. In this work including 69 patients I confirmed the prognostic value of cfDNA and mutated KRAS ctDNA, I demonstrated the interest of ctDNA kinetics to predict response to CT and I defined a combined score associating initial cfDNA and mutated KRAS ctDNA at D28, highly predictive of response to treatment. This combined score needs to be validated on a larger cohort to then develop a prospective phase II study with early change of CT guided by ctDNA.In the second part of my Thesis, I was interested in colorectal cancers (CCR) MSI whose therapeutic management is in full revolution with the major effectiveness of immunotherapy (IO) whose prescription depended on the diagnosis of the MSI phenotype. Currently, this MSI phenotype is determined by 2 techniques: immunohistochemistry (IHC) of DNA repair proteins and fragment analysis of the Pentaplex microsatellite panel. Performing this analysis using the high-throughput sequencing technique (Next Generation Sequencing, NGS) is important to be able to perform it in an “all-in-one” approach. We first selected and then tested in NGS an octaplex of microsatellites (CaBio) with the bioinformatic pipeline MSI Detection (MSID) on 391 tumors by comparing with the 2 reference techniques. Thus, we set up an NGS MSI phenotyping test the “CaBio-MSID octaplex” which has a sensitivity of 98.4% and a specificity of 98.4% for CRCs.Finally, the third part presented is still in progress and uses the octaplex CaBio-MSID and the pentaplex MSI by ddPCR (ddPCR-MSI) on ctDNA in a population treated for CCR MSI. These two technics were carried out in parallel to ensure the validity and consistency of results obtained. The preliminary results from 80 samples with 31 patients showed a sensitivity and a specificity of the ddPCR-MSI of 100% and 81.8%, respectively and 90.9% and 100% for the CaBio-MSID. The instability level reflected by allelic frequency of MONO-27 unstable seems to be correlated with the tumor response, with 79.2% of ctDNA-MSI detected by ddPCR-MSI for patients with tumor progression compared to 50% with the octaplex CaBio-MSID. These results should be interpreted with caution due to their preliminary character, the small population and several technical biases.These works confirm the clinical interest of ctDNA in digestive cancers to determine response to treatment earlier than standard radiological evaluations. Despite advances in molecular biology techniques, the main limitation of circulating DNA remains the sensitivity of detection, which needs to be improved and the different techniques need to be standardized on larger series. More importantly, the clinical impact of ctDNA must be demonstrated in prospective randomized trials of therapeutic adaptation according to the kinetics of ctDNA.