Apport de l’analyse protéomique pour comprendre la physiologie de Pseudomonas aeruginosa PA14 : impact de la supplémentation en source de carbone et caractérisation des facteurs de virulence

Αppοrt of prοtéοmic analysis to understand the physiοlοgy of Ρseudοmοnas aeruginοsa ΡΑ14 : impact of carbon dioxide supplementation and characterization of virulence factors

• Auteur / Autrice : Salomé Sauvage
• Direction : Julie Hardouin
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Chimie
• Date : Soutenance le 14/12/2022
• Etablissement(s) : Normandie
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale normande de chimie (Caen)
• Partenaire(s) de recherche : établissement co-accrédité : Université de Rouen Normandie (1966-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Polymères, biopolymères, surfaces (Saint-Etienne-du-Rouvray, Seine-Maritime ; 1974-...)
• Jury : Président / Présidente : Thierry Jouenne
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Thierry Clavel, Charlotte Cabanne
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Christine Carapito, Romé Voulhoux

Mots clés

Mots clés contrôlés

Bactéries -- Métabolisme

Virulence (microbiologie)

Protéines -- Modifications posttraductionnelles

Protéomique

Pseudomonas aeruginosa

Mots clés libres

Pseudomonas aeruginosa

Protéomique

Modifications post-traductionnelles

Sources de carbone

Virulence

Pseudomonas aeruginosa

Proteomics

Post-translational modifications

Carbon sources

Virulence

Résumé

P. aeruginosa est une bactérie pathogène opportuniste responsable de nombreuses infections nosocomiales. Sa résistance a une large gamme d’agents antimicrobiens rend ses infections très difficiles à traiter cliniquement. Par conséquent, il est urgent de développer rapidement de nouveaux traitements thérapeutiques plus efficaces. Pour cela, il faut avant tout comprendre les mécanismes mis en jeu par cette bactérie pour répondre à son environnement. Parmi ceux-ci, on retrouve les modifications post-traductionnelles (PTMs) et leurs enzymes associées, ainsi que les éléments impliqués dans le métabolisme adaptatif de P. aeruginosa à sa niche écologique. Dans ce contexte, les études protéomiques associées aux études phénotypiques sont des stratégies complémentaires pour caractériser les différents facteurs impliqués dans le métabolisme adaptatif de P. aeruginosa, et découvrir de nouvelles pistes de recherche pour lutter contre cette bactérie.Dans une première partie, nous avons cherché à caractériser les protéoformes du facteur de virulence majeur LasB de P. aeruginosa. Pour cela, nous avons construit un mutant exprimant la protéine LasB avec une étiquette 6 histidines (6His). La purification par chromatographie liquide d’affinité de cette protéine a été entreprise. Malheureusement, nous n’avons pas été en mesure d’isoler LasB6His quel que soit le compartiment cellulaire. Nous supposons qu’il y ait une dégradation potentielle de l’étiquette 6His lors du transfert de la protéine du milieu intra- au milieu-extracellulaire. Nous avons alors étudié le milieu périplasmique et obtenu des résultats préliminaires pour identifier des PTMs (phosphorylation des sérines, thréonines et tyrosines, et acétylation et succinylation des lysines) sur les protéines périplasmiques de P. aeruginosa à 6 et 24 heures de culture. Plusieurs peptides ont été retrouvés modifiés en fonction des conditions de culture. Plus précisément, nous avons observé certains acides aminés de LasB et CbpD dont les modifications sont conservées entre les différents compartiments (cytoplasme, périplasme, milieu extracellulaire).Dans une deuxième partie, nous avons réalisé une étude protéomique quantitative relative des compartiments intra- et extra-cellulaires de P. aeruginosa en fonction de différentes supplémentations en source de carbone (glucose, glutamate, succinate et citrate) afin d’étudier leur impact sur la physiologie de cette bactérie. Nous avons mis en évidence la prévalence de certaines voies métaboliques par rapport à d’autres en fonction des sources de carbone. Nous avons alors étudié plusieurs phénotypes (suivi de croissance, concentration minimale inhibitrice des antibiotiques, formation de biofilm, dosage de la pyocyanine…) pour confirmer ou non les hypothèses protéomiques. Ainsi, les sources de carbone modifient l'activation ou la répression de voies métaboliques spécifiques chez P. aeruginosa, soulignant l'importance de l'environnement dans lequel évolue la bactérie sur son comportement. En parallèle, nous avons observé des différences de comportement de nos milieux gélosés (MCG) supplémentés avec une source de carbone (glucose, glutamate, succinate et citrate) après gélification (détachement de la gélose plus ou moins aisée en fonction des milieux, de l’agar et de son pourcentage) comparé au milieu de référence utilisé en routine pour cet essai. Nous avons alors étudié la structure de ces MCG par rhéologie et microDSC.L’ensemble de ces travaux démontre que, grâce à la protéomique, la recherche fondamentale peut proposer de nouvelles hypothèses menant à l’exploration de nouvelles pistes potentiellement prometteuses. Ces données complétées par des études issues d’autres domaines (essais phénotypiques, étude métabolomique, étude génomique…) pourront aboutir à plus long terme à l’élaboration de thérapies efficaces contre P. aeruginosa.

P. aeruginosa is an opportunistic bacterial pathogen responsible for many hospital-acquired infections. Its resistance to a wide range of antimicrobial agents makes its infections very difficult to treat. Therefore, it is urgently necessary to rapidly develop new and more effective therapeutic treatments. To achieve this, it is imperative to understand the mechanisms by which this bacterium responds to its environment. These include post-translational modifications (PTMs) and their associated enzymes, as well as elements involved in the adaptive metabolism of P. aeruginosa to its ecological niche. In this context, proteomic studies combined with phenotypic studies are complementary strategies to characterize the different factors involved in the adaptive metabolism of P. aeruginosa, and to discover new fields of research to fight this bacterium.In a first part, we sought to characterize the proteoforms of the major virulence factor LasB of P. aeruginosa. For this purpose, we constructed a mutant expressing the LasB protein with a 6 histidines (6His) tag. Affinity liquid chromatography purification of this protein was undertaken. Unfortunately, we were unable to isolate LasB6His from any cell compartment. We assume that there is a potential degradation of the 6His tag during the transfer of the protein from the intra- to the extra-cellular medium. We then studied the periplasmic medium and obtained preliminary results to identify PTMs (phosphorylation of serines, threonines and tyrosines, and acetylation and succinylation of lysines) on P. aeruginosa periplasmic proteins at 6 and 24 hours of culture. Several peptides were found to be modified according to the culture conditions. More specifically, we observed certain amino acids of LasB and CbpD whose modifications are conserved between the different compartments (cytoplasm, periplasm, extracellular medium).In a second part, we carried out a relative quantitative proteomic study of the intra- and extra-cellular compartments of P. aeruginosa according to different carbon source supplements (glucose, glutamate, succinate and citrate) in order to study their impact on the physiology of this bacterium. We highlighted the prevalence of certain metabolic pathways in relation to others depending on the carbon source. We then studied several phenotypes (growth monitoring, minimum inhibitory concentration of antibiotics, biofilm formation, pyocyanin quantification, etc.) to confirm or not the proteomic hypotheses. Thus, carbon sources modify the activation or repression of specific metabolic pathways in P. aeruginosa, underlining the importance of the environment in which the bacterium evolves on its behaviour. In parallel, we observed differences in the behaviour of our agar media (MCG) supplemented with a carbon source (glucose, glutamate, succinate and citrate) after gelation (more or less easy detachment from the agar depending on the media, the agar and its percentage) compared to the reference medium used routinely for this test. We then studied the structure of these MCG by rheology and microDSC.All of this work demonstrates that, thanks to proteomics, basic research can propose new hypotheses leading to the exploration of new potentially promising avenues. These data, supplemented by studies from other fields (phenotypic assays, metabolomic studies, genomic studies, etc.), may lead in the longer term to the development of effective therapies against P. aeruginosa.