Développement de nouvelles molécules pour caractériser la leucémie lymphocytaire chronique.

Development of new molecular tools to characterise Chronic lymphocytic leukemia

• Auteur / Autrice : Xuan Lan
• Direction : Fabrice Jardin, Hervé Tilly
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Aspects moleculaires et cellulaires de la biologie
• Date : Soutenance le 05/12/2022
• Etablissement(s) : Normandie
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Normande de biologie intégrative, santé, environnement (Mont-Saint-Aignan, Seine-Maritime)
• Partenaire(s) de recherche : Établissement de préparation : Université de Rouen Normandie (1966-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Cancer and Brain Genomics (Rouen ; 2022-....)
• Jury : Président / Présidente : David Rizzo
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Fabrice Jardin, Hervé Tilly, David Rizzo
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Brigitte Gubler, Marie-Hélène Delfau-Larue

Mots clés

Mots clés contrôlés

Récepteurs

Lymphocytes B

Gène p53

Immunoglobulines

Leucémie lymphoïde chronique

Mots clés libres

Leucémie lymphocytaire chronique

Immunoglobuline

Récepteur des cellules B

5'RACE

RT-MLPA

TP53

Chronic lymphocytic leukaemia

Immunoglobulin

B-cell receptor

5’RACE

RT-MLPA

TP53

Résumé

La leucémie lymphocytaire chronique (LLC) est très répandue dans le monde occidental et se concentre sur les hommes âgés. La maladie présente une hétérogénéité importante, ce qui rend particulièrement important de trouver des biomarqueurs et des tests stables pour guider le pronostic et les options de traitement de la maladie. Ce projet de recherche doctoral vise à améliorer l'étude des biomarqueurs dans la LLC par le séquençage de nouvelle génération (NGS). D'une part, nous avons développé une nouvelle approche pour détecter le statut mutationnel de l'IGHV, un biomarqueur pronostique essentiel dans la LLC. Par rapport à la méthode de routine, le 5'RACE est plus sensible pour traiter les réarrangements multiples et improductifs de l'IGH. De plus, grâce à la supériorité du NGS, nous pouvons obtenir simultanément des informations sur la chaîne légère de l'immunoglobuline (IGL). Par conséquent, en combinant les données des chaînes légères, nous avons constaté que la chaîne lourde présentait un statut d'identité mutationnelle avec la chaîne légère chez la plupart des patients atteints de LLC. Cette découverte confirme que la chaîne légère peut également guider la stratégie diagnostique et thérapeutique de la LLC, en particulier dans les cas limites. Nous avons également confirmé l'existence d'un groupe spécial présentant des mutations ponctuelles en position 110 de l'IGLV3-21, dont le pronostic est aussi mauvais que celui des patients non mutés, même si la majeure partie de leur IGHV est mutée.TP53, un autre biomarqueur important de la LLC, surtout à l'ère des nouvelles thérapies ciblées. Les méthodes de routine se concentrent sur les informations de l'ADN et sous-estiment le rôle de l'ARN. De plus, le séquençage de l'ARN long n'est pas largement utilisé en raison de son prix élevé et des instruments spéciaux qu'il nécessite. Afin d'obtenir plus de détails sur les gènes au niveau de l'ARNm, nous avons conçu une nouvelle méthode, la RT-MLPA (reverse-transcriptase multiplex ligation-dependent probe amplification), qui permet de détecter l'expression de plusieurs gènes grâce à un pool de sondes flexible. Nous avons confirmé la fiabilité de la RT-MLPA par une lignée cellulaire et un patient a montré une mutation du site d'épissage. Entre-temps, RT-MLPA surveille également la diminution de la mutation causée par l'inhibiteur BTK, ce qui concorde avec les résultats du séquençage de l'ADN. Nous avons démontré que le SNP TP53 Arg72Pro détecté par RT-MLPA au niveau de l'ARNm est fortement corrélé avec les résultats obtenus par NGS au niveau de l'ADN chez 114 patients atteints de LLC. De manière inattendue, nous avons trouvé deux SNP TP53 (rs1625895 et rs2909430), exprimés chez les mêmes patients, qui ont montré une corrélation étroite avec TP53mut (p=0,001). Nous avons également analysé l'influence des biomarqueurs de mauvais pronostic. De manière intéressante, l'aberration TP53 et le SF3B1mut exprimaient un niveau plus faible de l'exon 4-5 de TP53, qui est une partie spécifique des isoformes FLp53 et Δ40p53. L'IGHV non muté a montré une plus faible expression de l'exon 9-9b et de l'exon 9bg-10, qui est spécifique de p53β. NOTCH1mut a montré une plus faible expression de l'exon 10-11, qui appartient à p53α. Par conséquent, la RT-MLPA est une méthode stable pour détecter l'expression au niveau de l'ARNm et surveiller la réponse thérapeutique. L'expression différente d'exon-jonctions spécifiques parmi les biomarqueurs met en évidence le rôle des isoformes de p53 dans la LLC, élargissant le champ de recherche de TP53.

Chronic lymphocytic leukaemia (CLL) is highly prevalent in the Western world and is concentrated in older men. The disease exhibits significant heterogeneity, making it particularly important to find stable biomarkers and assays to guide the prognosis and treatment options for the disease. This PhD research project aims to improve the study of biomarkers in CLL by next-generation sequencing (NGS). On the one hand, we developed a novel approach to detect the mutational status of IGHV, an essential prognostic biomarker in CLL. Compared with the routine method, 5’RACE is more sensitive to handling multiple and unproductive rearrangements of IGH. Moreover, due to the superiority of NGS, we can obtain information on the immunoglobulin light chain (IGL) simultaneously. Therefore, combined with the data of light chains, we found that the heavy chain showed mutational identity status to the light chain in most CLL patients. This finding supports that the light chain can also guide the diagnostic and therapeutic strategy of CLL, especially in borderline cases. We also confirmed a special group with point mutations in position 110 of IGLV3-21, which showed a similarly poor prognosis to IGHV-unmutated patients, even though most of their IGHV is mutated.TP53, another important biomarker of CLL especially in the era of new target therapy. The routine methods focus on the DNA information and underestimate the role of RNA. Moreover, long RNA sequencing isn’t widely used due to its high price and special instruments. In order to get more detail of gene at mRNA level, we designed a new method, reverse-transcriptase multiplex ligation-dependent probe amplification (RT-MLPA), which can detect the expression of multiple genes by a flexible probes pool. We confirmed the reliability of RT-MLPA by a cell line and a patient showed a splice site mutation. Meantime, RT-MLPA also surveillance the decrease of mutation cause by BTK inhibitor, which is concordance with the results of DNA sequencing. We demonstrated that SNP TP53 Arg72Pro detected by RT-MLPA at mRNA level highly correlated with results by NGS at DNA level in 114 CLL patients. Unexpectedly, we found two TP53 SNPs (rs1625895 and rs2909430), expressed in same patients, showed a close correlation with TP53mut (p=0.001). We also analyzed the influence of poor prognosis biomarkers. Interestingly, TP53 aberration and SF3B1mut expressed a lower level of TP53 exon 4-5, which is specific part of FLp53 and Δ40p53 isoforms. Unmutated IGHV showed lower expression of exon 9-9b and exon 9bg-10, which is specific of p53β. NOTCH1mut showed lower expression of exon 10-11, which is belonging to p53α. Therefore, RT-MLPA is a stable method to detect the expression at mRNA level and surveillance the therapeutic response. The different expression of specific exon-junctions among biomarkers highlights the role of p53 isoforms in CLL, extend the research field of TP53.