Rôle de la SELENOT dans la régulation de l'homéostasie du réticulum endoplasmique dans les neurones à POMC

Role of SELENOT in the regulation of endoplasmic reticulum homeostasis in POMC neurons

• Auteur / Autrice : Cedric Jehan
• Direction : Isabelle Lihrmann-Bisson
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Aspects moleculaires et cellulaires de la biologie
• Date : Soutenance le 17/11/2022
• Etablissement(s) : Normandie
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Normande de biologie intégrative, santé, environnement (Mont-Saint-Aignan, Seine-Maritime)
• Partenaire(s) de recherche : Etablissement de préparation de la thèse : Université de Rouen Normandie (1966-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Neuroendocrine EndOcrine and GeRminal DIfferentiation and Communication (Mont-Saint-Aignan, Seine-Maritime ; 2022-....)
• Jury : Président / Présidente : Muriel Bardor
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : François Foulquier, Youssef Anouar, Carole Rovere-Jovene, Alain Lescure
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : François Foulquier

Mots clés

Mots clés contrôlés

Thiorédoxine

Homéostasie

Glycosylation

Réticulum endoplasmique

Sélénium

Mots clés libres

Sélénium

Sélénoprotéines

Réticulum endoplasmique

Calcium

N-glycosylation

Homéostasie redox

Selenium

Selenoproteins

Endoplasmic reticulum

Calcium

N-glycosylation

Redox homeostasis

Résumé

La sélénoprotéine T est une protéine de type thiorédoxine qui est fortement exprimée au cours du développement et dans certains tissus sécréteur (endocrine/neuroendocrine) à l'âge adulte. Par un criblage de levure en double hybride et des expériences d'immunoprécipitation, son interaction avec le complexe oligosaccharyltransférase a été démontrée ainsi que son rôle dans la glycosylation de la proopiomélanocortine dans les cellules corticotropes. Cependant, l’importance de sa fonction redox dans ce processus n'est pas encore connue.Nous avons utilisé un modèle cellulaire de neurones à POMC, mhypoA-POMC, obtenus à partir d’hypothalamus de souris pour générer deux lignées invalidées de manière stable pour la SELENOT par l’approche CRISPR-Cas9. Nous avons constaté dans les lignées KO une augmentation de la surface cellulaire, un aplatissement de la cellule, un étalement du RE, une perte des contacts entre le RE et la membrane plasmique, une augmentation de l’endocytose, un défaut d’extension des neurites, et une expression de la β-galactosidase. Cet ensemble de modifications suggère que les cellules KO pour la SELENOT sont sénescentes. Nous avons aussi observé la perte spécifique de certains polysaccharides dans les cellules invalidées pour la SELENOT, en particulier les glycanes sialylés. L’étude de la topologie de la SELENOT révèle qu’elle adopte une structure en épingle à cheveux, le site catalytique CVSU émergeant dans la lumière du RE. Une approche de thiol trapping et de spectrométrie de masse a mis en évidence une interaction de la SELENOT avec une dizaine de partenaires redox potentiels, parmi lesquels le récepteur de l'inositol trisphosphate de type 1 (IP3R1), un canal du RE responsable de la mobilisation calcique, et ERLIN2, une protéine régulant l’expression d’IP3R1. Par ailleurs, une interaction indépendante des cystéines du centre redox avec le complexe OST (sous unités STT3A, STT3B, OST48, RPN1, RPN2, malectine) a aussi été observée.En conclusion nous proposons que la SELENOT est impliquée dans le contrôle de l’activité d’IP3R1 en permettant sa N glycosylation et/ou en modifiant l’état redox de ses cystéines régulatrices, ou éventuellement en interagissant de façon redox avec ERLIN2.

Selenoprotein T is a thioredoxin-like protein that is highly expressed during development and in certain secretory tissues (endocrine/neuroendocrine) in adulthood. By yeast two-hybrid screening and immunoprecipitation experiments, its interaction with the oligosaccharyltransferase complex was demonstrated as well as its role in the glycosylation of proopiomelanocortin in corticotropic cells. However, the importance of its redox function in this process is not yet known.We used a cell model of POMC neurons, mhypoA-POMC, obtained from mouse hypothalamus to generate two lines stably invalidated for SELENOT by the CRISPR-Cas9 approach. We found in the KO lines an increase in cell surface area, cell flattening, spreading of the ER, loss of contacts between the ER and the plasma membrane, increased endocytosis, a defect in neurite extension, and expression of β-galactosidase. This set of changes suggests that SELENOT KO cells are senescent. We also observed the specific loss of certain polysaccharides in SELENOT-knockout cells, in particular sialylated glycans. Study of the topology of SELENOT reveals that it adopts a hairpin structure, with the CVSU catalytic site emerging in the ER lumen. A thiol trapping and mass spectrometry approach revealed an interaction of SELENOT with about ten potential redox partners, including the inositol trisphosphate receptor type 1 (IP3R1), an ER channel responsible for calcium mobilisation, and ERLIN2, a protein regulating IP3R1 expression. Furthermore, an independent interaction of the redox centre cysteines with the OST complex (STT3A, STT3B, OST48, RPN1, RPN2, malectin) was also observed.In conclusion, we propose that SELENOT is involved in the control of IP3R1 activity by allowing its N-glycosylation and/or by modifying the redox state of its regulatory cysteines, or possibly by interacting in a redox manner with ERLIN2.