Amélioration de la production d'anticorps recombinants chez la diatomée Phaeodactylum tricornutum

Improvement of recombinant antibodies production in the diatom Phaeodactylum tricornutum

• Auteur / Autrice : Charlotte Toustou
• Direction : Muriel Bardor
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Aspects moleculaires et cellulaires de la biologie
• Date : Soutenance le 25/04/2022
• Etablissement(s) : Normandie
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Normande de biologie intégrative, santé, environnement (Mont-Saint-Aignan, Seine-Maritime)
• Partenaire(s) de recherche : Etablissement de préparation de la thèse : Université de Rouen Normandie (1966-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Laboratoire de glycobiologie et matrice extracellulaire végétale (Mont Saint-Aignan (Seine-Maritime) ; 2009-....)
• Jury : Président / Présidente : Patrice Lerouge
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Sébastien Calbo, Christian Dubos, Angela Falciatore, Marie-Christine Kiefer-Meyer
• Jury : Rapporteur / Rapporteuse : Fayza Daboussi, Pierre Martineau

Mots clés

Mots clés contrôlés

Facteurs de transcription

Adressage des protéines

Biotechnologie marine

Protéines recombinées

Anticorps monoclonaux

Biologie moléculaire

Diatomées

Mots clés libres

Phaeodactylum tricornutum

Diatomées

Anticorps monoclonaux

Biologie moléculaire

Protéines recombinantes

Bioproduction

Biotechnologie

Promoteurs

Terminateurs

Peptides signaux

Phaeodactylum tricornutum

Diatoms

Monoclonal antibodies

Molecular biology

Recombinant proteins

Bioproduction

Biotechnology

Promotors

Terminators

Signal peptide

Résumé

Le marché des anticorps monoclonaux (mAbs) est en plein essor en raison de leur utilisation dans le traitement de nombreuses maladies chroniques et inflammatoires. Cependant, les systèmes de production utilisés présentent des inconvénients qui incitent la communauté scientifique à se tourner vers de nouvelles alternatives telles que les microalgues. Des études récentes ont démontré la capacité de la diatomée P. tricornutum à produire des mAbs fonctionnels dirigés contre certains virus, mais les rendements de production obtenus sont trop faibles pour prétendre à un passage à l’échelle industrielle. Afin d’étendre la preuve de concept de la production de mAbs chez la diatomée P. tricornutum, nous avons focalisé nos travaux sur la production d’un anticorps anti-HER2 en utilisant un nouveau design de vecteur. Malheureusement, un problème de contamination détecté en fin de thèse ne nous permet pas aujourd’hui de conclure définitivement sur l’efficacité de ces vecteurs pour la production de mAbs anticancéreux fonctionnels chez P. tricornutum. La deuxième partie de ce travail s’est concentrée sur le développement de différentes approches afin d’augmenter le rendement de production de mAbs chez cette diatomée. Nous avons d’abord caractérisé de nouveaux promoteurs de gènes exprimés dans des conditions de faible salinité en se basant sur des données de transcriptomiques précédemment publiées par le laboratoire. Sur les 28 promoteurs testés, nous avons montré que 13 d’entre eux étaient capables de conduire à l’expression de la protéine rapportrice eGFP. Parmi eux, nous avons démontré que le promoteur VOC est une alternative prometteuse au promoteur NR, utilisé jusqu’à présent pour la production de mAbs chez P. tricornutum. En parallèle, nous avons identifié des éléments spécifiques du vecteur d’expression permettant une augmentation du rendement de sécrétion des mAbs dans le milieu de culture de la diatomée. Nous avons mis en évidence que l’utilisation du terminateur du gène fcpA était plus efficace pour augmenter le rendement de production comparativement aux terminateurs endogènes associés aux promoteurs testés. De plus, nous avons montré que l’utilisation de peptides signaux hétérologues augmentait de façon surprenante la sécrétion des mAbs dans le milieu de culture par rapport au peptide signal de la protéine endogène HASP1, la protéine la plus abondamment sécrétée par la diatomée. Dans l'ensemble, ces résultats contribuent à la découverte de nouveaux outils génétiques et d'éléments du vecteur d’expression qui permettent d'augmenter la quantité de mAbs sécrétés et accumulés dans le milieu de culture de P. tricornutum.

The market share of monoclonal antibodies (mAbs) is expanded rapidly due to their increasing use in the treatment of many chronic and inflammatory diseases. However, the current production systems present several drawbacks that are prompting the scientific community to explore new alternatives such as microalgae. Recent studies have shown the ability of the diatom P. tricornutum to produce functional mAbs directed against viruses, but the production yields are too low for the production at an industrial scale. In order to extend the proof of concept, we attempted to produce an anti-Her2 antibody in P. tricornutum using a new vector design. Unfortunately, a contamination problem detected at the end of the thesis does not allow us to definitively conclude on the efficacy of these vectors for the production of functional anti-cancer mAbs in P. tricornutum. The second part of this work focused on the development of different approaches to increase the mAbs production yield in this diatom. We first characterised new promoters of genes overexpressed under low salinity conditions based on transcriptomic data previously published by the laboratory. Of the 28 promoters tested, we showed that 13 of them were capable of driving the expression of the eGFP reporter protein. Among them, we demonstrated that the VOC promoter is a promising alternative to the NR promoter used until now for the production of mAbs in P. tricornutum. In parallel, we identified specific elements of the expression vector that allow an increase in the secretion yield of mAbs in the diatom culture medium. We also demonstrated that the use of the fcpA gene terminator was more effective in increasing the production yield compared to the endogenous terminators associated with the tested promoters. Furthermore, we showed that the use of heterologous signal peptides surprisingly increased the secretion of mAbs into the culture medium compared to the signal peptide of HASP1, the most abundant secreted endogenous protein. Overall, these results contribute to the discovery of new genetic tools and vector elements that allow to increase the amount of mAbs secreted and accumulated in P. tricornutum culture medium.