Clonage et ingénierie de nouvelles cellulases isolées à partir de souches bactériennes du lac Bogoria (Kenya) et applications biotechnologiques

Cloning and engineering of new cellulases isolated from Lake Bogoria strains and biotechnological applications

• Auteur / Autrice : Lydia Ogonda
• Direction : Charles Tellier, Francis Mulaa
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie médecine santé
• Date : Soutenance le 23/11/2022
• Etablissement(s) : Nantes Université en cotutelle avec University of Nairobi
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Biologie-Santé (Nantes)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Unité en sciences biologiques et biotechnologies (Nantes)
• Jury : Président / Présidente : Cyrille Grandjean
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Sylvain Tranchimand
• Jury : Rapporteur / Rapporteuse : Claire Dumon, Magnus Wolf-Watz

Mots clés

Mots clés contrôlés

Rift Valley (Kenya ; province)

Bactéries thermophiles

Cellulose

Mots clés libres

Endoglucanase

Cellobiohydrolase

Bacillus pumilus

Cellulosome

Résumé

Le lac Bogoria située dans la région volcanique de la « rift valley » au Kenya est un écosystème intéressant qui héberge des bactéries de type alcalino-thermophile. A partir d’isolats de souches bactériennes collectées sur les rives du lac, nous avons vérifié la présence d’activités cellulolytiques et entrepris de les cloner. Les gènes correspondant à deux nouvelles cellulases, une endocellulase (BpGH9) et une cellobiohydrolase (BpGH48) ont été surexprimés dans une souche recombinante, puis les cellulases correspondantes ont été purifiées et caractérisées biochimiquement. L’endocellulase BpGH9 présente une excellente tolérance aux pH extrêmes. L’endocellulase BpGH9 a une structure modulaire dans laquelle le module catalytique est fusionné avec un module de reconnaissance de la cellulose (CBM3c). Des expériences d’ingénierie moléculaire impliquant la troncation et la fusion de CBMs ont permis de préciser le rôle de ces modules dans l’hydrolyse de la cellulose. Ces nouvelles constructions moléculaires dérivées de BpGH9 ont ensuite été utilisées pour faciliter l’extraction de composés hydrocarbonés à partir de la microalgue, Botryococcus braunii. Les résultats indiquent qu’il est possible de désorganiser efficacement les colonies de B. Braunii par une hydrolyse avec des endocellulases grâce à la présence de glucanes dans la matrice extracellulaire entourant les cellules. Dans une dernière étape, nous avons exploité la tolérance à la fusion des activités cellulasiques pour construire des complexes multienzymatiques s’inspirant des édifices supramoléculaires observés dans les cellulosomes. Une approche originale dans laquelle les activités enzymatiques pourront être organisées « en ligne » est proposée dans le but d’améliorer la digestion de la cellulose.

Lake Bogoria, located in the volcanic region of the rift valley in Kenya, is an interesting ecosystem that hosts alkalinothermophilic bacteria. From isolates of bacterial strains collected from the shores of the lake, we verified the presence of cellulolytic activities and undertook to clone them. The genes corresponding to two new cellulases, an endocellulaes (BpGH9) and a cellobiohydrolase (BpGH48) were overexpressed in a recombinant strain, then the corresponding cellulases were purified and biochemically characterized. The endocellulase has a modular structure in which the catalytic module is fused with a cellulose binding module (CBM3c). Molecular engineering experiments involving the trucation and fusion of These new molecular constructs derived from BpGH9 were then used to facilitate the extraction of hydrocarbon compounds from the microalgae, Botriococcus braunii. The results indicate the B. Braunii colonies can be effectively disrupted by treament with endo cellulases through the hydrolysis of glucanes in the extracellular matrix surrounding the cells. In a final step, we exploited the fusion tolerance of cellulase activities to construct multienzyme complexes inspired by the supramolecular assemblies observed in cellulosomes. An original approach in which enzymatic activities can be organized “in line” is proposed to improve celulose digestion.