Régulation des canaux NaV1.5 cardiaques par la phosphorylation de leur protéine partenaire FHF2

Regulation of cardiac NaV1.5 channels by FHF2 phosphorylation

• Auteur / Autrice : Adrien Lesage
• Direction : Céline Marionneau
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie, médecine et santé
• Date : Soutenance le 16/12/2022
• Etablissement(s) : Nantes Université
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Biologie-Santé (Nantes)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : L'Unité de Recherche de l'Institut du Thorax (Nantes)
• Jury : Président / Présidente : Isabelle Baró
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Laurent Sallé, Jean-François Faivre

Mots clés

Mots clés contrôlés

Cardiomyocytes

Phosphorylation

Canal sodique voltage-dépendant NAV1.5

Mots clés libres

NaV1.5

FHF2

Protéines partenaires

Résumé

Les canaux sodiques dépendants du potentiel NaV1.5 sont responsables de l'initiation et de la propagation rapide des potentiels d'action cardiaques, et tout défaut de fonctionnement ou de régulation de ces canaux est à l'origine de diverses formes d’arythmies cardiaques. Bien que le rôle de la phosphorylation de la sous-unité α du canal NaV1.5 soit bien connu dans la régulation de l'expression et du fonctionnement du canal, la régulation des canaux NaV1.5 par la phosphorylation de ses protéines partenaires reste largement inexplorée. Une analyse phosphoprotéomique des complexes canalaires NaV1.5 purifiés à partir de ventricules gauches de souris a été développée au laboratoire afin d’identifier les sites de phosphorylation des protéines partenaires du canal. Parmi elles, la protéine FHF2 (Fibroblast Growth Factor Homologous Factor 2) a montré une forte phosphorylation au niveau de 9 sites spécifiques. Afin de déterminer les rôles fonctionnels de ces sites de phosphorylation dans la régulation des canaux Nav1.5, nous avons développé deux modèles de cardiomyocytes en culture dans lesquels l'expression endogène de FHF2 est éteinte et restaurée à l’aide d’adénovirus par l’isoforme FHF2-VY sous sa forme sauvage (WT), phosphosilencieuse (mutations des sérines/thréonines d’intérêt en alanines) ou phosphomimétique (mutations en glutamates) dans des cardiomyocytes ventriculaires isolés à partir de souris néonatales ou adultes. Le système d’expression hétérologue HEK-293 a également été utilisé en parallèle. Les analyses de voltage-clamp en configuration cellule entière ont démontré que l’extinction de FHF2 accélère l'inactivation des canaux NaV à partir des états fermé et ouvert dans les cardiomyocytes ventriculaires de souris néonatales et adultes. De façon intéressante, l’extinction de FHF2 déplace également la dépendance au potentiel de l'activation des canaux NaV vers des potentiels hyperpolarisés dans les cardiomyocytes ventriculaires néonataux. Bien que la restauration de l’expression de FHF2-VY restaure les propriétés d'inactivation des canaux NaV dans les deux modèles de cardiomyocytes, aucune réversion des propriétés d'activation n'a été obtenue dans les cardiomyocytes néonataux, suggérant l'implication potentielle d'une autre isoforme de FHF2 dans la régulation des propriétés d'activation des canaux NaV néonataux. Cependant, malgré les nombreux phosphomutants testés, chacun d’entre eux a rétabli les propriétés d'inactivation des canaux NaV de manière similaire au construit FHF2-VY sauvage dans les deux modèles de cardiomyocytes, ne permettant pas d'identifier les rôles des sites de phosphorylation du FHF2 nouvellement identifiés dans la régulation des canaux NaV1.5. De manière similaire, aucun rôle des sites de phosphorylation n’a pu être révélé dans la régulation du courant sodique persistant dans les cardiomyocytes ventriculaires adultes. En conclusion, nos résultats démontrent que la protéine FHF2 est fortement phosphorylée dans le ventricule gauche de souris, confirment les rôles régulateurs de FHF2 dans la régulation des propriétés d’inactivation des canaux NaV1.5, révèlent le rôle potentiel des isoformes de FHF2 dans la régulation des propriétés d’activation du canal, et suggèrent que la régulation des canaux par la phosphorylation de FHF2 est probablement très complexe.

The voltage-gated sodium channels NaV1.5 are responsible for the initiation and fast propagation of cardiac action potentials, and dysregulations of this channel underlie diverse forms of inherited or acquired cardiac disease. While phosphorylation of the NaV1.5 channel pore-forming subunit is extensive and recognized to mediate several molecular aspects of channel expression and function, the regulation of NaV1.5 channels by phosphorylation of its accessory proteins remains largely unexplored. A mass spectrometry-based phosphoproteomic analysis of mouse ventricular NaV1.5 channel complexes was undertaken to identify the native phosphorylation sites of NaV1.5 channel accessory proteins. Among the various accessory proteins identified in NaV1.5 channel complexes, the Fibroblast Growth Factor Homologous Factor 2 (FHF2) showed extensive phosphorylation at 9 specific sites. In order to determine the functional roles of these newly-identified FHF2 phosphorylation sites, we developed two novel cellular models in which the expression of endogenous FHF2 is knockdowned in isolated neonatal mouse ventricular cardiomyocytes using shRNA-expressing adenoviruses, or adult ventricular cardiomyocytes isolated from cardiac-specific FHF2 knockdown mice. The expression of FHF2 was then rescued in both cellular models using adenoviruses expressing the major ventricular FHF2 isoform, FHF2-VY, in its wild-type (WT), phosphosilent (mutations to alanine) or phosphomimetic (mutations to glutamate) forms at specific sites Whole cell voltage-clamp analyses demonstrated that FHF2 knockdown accelerates the rate of closed-state and open-state inactivation of NaV channels in both neonatal and adult cardiomyocytes. Interestingly, FHF2 knockdown also shifted the voltage-dependence of NaV channel activation towards hyperpolarized potentials in neonatal cardiomyocytes. Although the rescue of FHF2 with WT FHF2-VY restored the inactivation properties of NaV channels in both neoanatal and adult cardiomyocytes, no restoration of the activation properties was obtained in neonatal cardiomyocytes, suggesting the involvement of another FHF2 isoform in regulating the activation properties of NaV channels in neonatal cardiomyocytes. However, similar to WT FHF2-VY, each of the analyzed FHF2-VY phosphomutants restored the inactivation properties of NaV channels in both cellular models, preventing to identify roles for FHF2 phosphorylation sites in regulating NaV1.5 channels. Further investigation also demonstrated that FHF2 knockdown increases the late Na+ current in adult cardiomyocytes, which was similarly restored with WT and phosphosilent FHF2-VY. Taken together, our results demonstrate that ventricular FHF2 is highly phosphorylated, implicate critical and differential roles for FHF2 in regulating NaV1.5 channels in neonatal and adult ventricular cardiomyocytes, and suggest that the regulation of NaV1.5 channels by FHF2 phosphorylation is certainly highly complex.