Rôle de peptides antimicrobiens de la famille des « non-specific lipid transfer proteins » dans la symbiose actinorhizienne

Role of antimicrobial peptides of the ''non-specific lipid transfer proteins'' family in actinorrhizal symbiosis

• Auteur / Autrice : Mélanie Gasser
• Direction : Hasna Boubakri
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Microbiologie
• Date : Soutenance le 22/06/2022
• Etablissement(s) : Lyon
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Evolution Ecosystèmes Microbiologie Modélisation (Lyon ; 1999-....)
• Partenaire(s) de recherche : établissement opérateur d'inscription : Université Claude Bernard (Lyon ; 1971-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Écologie Microbienne Lyon
• Jury : Président / Présidente : Florence Wisniewski-Dyé
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Hasna Boubakri, Pierre Frendo, Céline Landon, Sébastien Rigali, Guy Condemine
• Jury : Rapporteur / Rapporteuse : Pierre Frendo, Céline Landon, Sébastien Rigali

Mots clés

Mots clés contrôlés

Peptides antimicrobiens

Actinobactéries

Symbiose

Aulne glutineux

Mots clés libres

Frankia

Non specific lipid transfer protein

Peptide antimicrobien

Fixation d'azote

Actinorhizienne

Symbiose

Frankia

Non specific lipid transfer protein

Antimicrobial peptide

Nitrogen fixing

Actinorhizal

Symbiosis

Résumé

Les plantes actinorhiziennes regroupent 8 familles de plantes appartenant aux ordres des Fagales, Cucurbitales et Rosales réunissant près de 220 espèces. Parmi ces familles, le genre Alnus regroupe 30 espèces dont l’espèce européenne Alnus glutinosa (Aulne glutineux) capable de coloniser les biotopes pauvres en azote grâce à sa capacité à établir des symbioses avec des actinobactéries filamenteuses fixatrices d’azote du genre Frankia. La reconnaissance entre les deux partenaires initie un programme symbiotique au niveau des racines aboutissant à la formation d’un nouvel organe, la nodosité, dédiée aux échanges trophiques. Au sein de cette nodosité, l’actinobactérie fixe l’azote atmosphérique grâce à des cellules différenciées en diazovésicules et fournit ainsi des composés azotés à la plante qui en échange transfère des composés carbonés dérivés de son activité photosynthétique. Les mécanismes moléculaires impliqués sont encore peu connus Malgré cela, des études physiologiques, et transcriptomiques sur des pré-nodules et des nodosités ont permis d’élucider certains mécanismes comme la présence d’une voie de signalisation commune aux symbioses, appelée voie SYM (Symbiotic signalling pathway). En effet, elle est décrite également chez les légumineuses en association avec les rhizobia et chez les plantes en association avec les champignons mycorhiziens. Les données transcriptomiques d’A. glutinosa ont permis d’identifier que parmi les gènes surexprimés dans les étapes précoces de la symbiose, 80% codent des peptides sécrétés. Parmi ces peptides, certains sont qualifiés de peptides antimicrobien (AMPs) qui sont décrit dans la littérature comme jouant un rôle dans l’immunité innée de la plante. Cependant, les AMPs ont aussi été décrits comme jouant un rôle crucial durant la symbiose. En effet, il a déjà été montré que des AMPs de la famille des défensines, produites par A. glutinosa contrôlent le symbiote dans la nodosité. Parmi celles-ci, AgDef5, cible le symbiote au niveau des diazovésicules diazovésicules fixatrices d’azote dans les cellules végétales infectées de la nodosité et permettrait d’améliorer les échanges trophiques entre les deux partenaires. Dans ces données transcriptomiques, des gènes codant une deuxième famille d’AMPs, des « non-specific lipid transfert protein » (nsLTPs), sont également surexprimés. Ces peptides possèdent 4 ponts disulfures qui conduisent à la formation d’une cavité hydrophobe permettant de transférer des lipides. Le rôle biologique des nsLTPs reste très peu connu bien qu’elles interviennent dans de nombreux processus biologiques tels que la résistance au stress, à la reproduction, la formation du tube pollinique, le développement et la germination des graines, la formation de cuticule, les défenses de la plante face à des attaques de pathogènes, ou les symbioses fixatrices d’azote impliquant les légumineuses et les rhizobia. L’un de ces gènes, agltp24, est le plus surexprimé dans les étapes précoces suite à la colonisation par la bactérie symbiotique mais aussi dans la nodosité ce qui suggère un rôle important de cet AMP de la mise en place et dans maintien de la symbiose. Ces travaux de thèse ont pour but d’étudier le rôle des nsLTPs dans la symbiose entre A. glutinosa et la bactérie Frankia alni ACN14a. La première partie avait pour but de localiser AgLTP24 dans les tissus végétaux à différents stades de la symbiose et de déterminer ses effets physiologiques sur le symbiote bactérien Frankia afin d’identifier de possibles fonctions biologique. La deuxième partie de ces travaux s’est focalisée sur la réponse moléculaire du symbiote face à AgLTP24. Plus largement, étant donné que le rôle des nsLTPs dans les symbioses fixatrices d’azote reste encore très peu décrit, l’identification de ces peptides chez des plantes nodulantes et non nodulantes a été menée en vue de déterminer leurs distributions et leurs histoire évolutive au sein des symbioses fixatrices d’azote.

The actinorhizal plants include 8 families of plants belonging to the orders of Fagales, Cucurbitales and Rosales gathering nearly 220 species. Among these families, the genus Alnus includes 30 species including the European species Alnus glutinosa (Black Alder) able to colonize nitrogen-poor biotopes thanks to its ability to establish symbioses with filamentous nitrogen-fixing actinobacteria of the genus Frankia. The recognition between the two partners initiates a symbiotic program at the root level leading to the formation of a new organ, the nodule, dedicated to trophic exchanges between the two partners. Within this nodule, the actinobacterium fixes atmospheric nitrogen through cells differentiated into vesicles and thus provides nitrogenous compounds to the plant which in exchange transfers carbon compounds derived from its photosynthetic activity. The recognition, entry and maintenance of the bacterium in the nodule require a fine coordination on the part of the two partners which governs through the establishment of a molecular dialogue. The molecular mechanisms involved are still poorly understood, as genetic engineering modifications of the Frankia bacterium have yet to be developed. Nevertheless, physiological and transcriptomic studies on pre-nodules and nodules have allowed to elucidate several mechanisms such as a symbiotic signalling pathway. Indeed, it is also described in legumes in association with rhizobia and in plants in association with mycorrhizal fungi. These transcriptomic data from A. glutinosa, obtained with microarrays targeting 13000 transcribed genes of the plant (EST: Expressed sequence tag), allowed to identify that among genes overexpressed at the early stages of symbiosis, 80% encode secreted peptides. Among these peptides, some are qualified as antimicrobial peptides (AMPs) which are described in the literature as playing a role in the innate immunity towards plant to pathogenic microorganisms. However, AMPs have also been described as playing a crucial role during symbiosis. Indeed, it has already been shown that AMPs of the defensin family, produced by A. glutinosa control the symbiont in the nodule. Among these secreted defensins, AgDef5, targets the symbiont at the level of the nitrogen-fixing vesicles in the infected plant cells of the nodule and would improve trophic exchanges between the two partners. In these transcriptomic data, genes encoding a second family of AMPs, the non-specific lipid transfer proteins (nsLTPs), are also overexpressed. These peptides have 4 disulfide bridges that lead to the formation of a hydrophobic cavity allowing lipids transfer. The biological role of nsLTPs is still poorly described although they are involved in several biological processes such as stress resistance, reproduction, pollen tube formation, seed germination, cuticle formation, plant defense against pathogen attacks, or symbiosis between legumes and rhizobia. One of these genes, agltp24, is the most overexpressed at the early stage following colonization by the symbiotic bacteria but also in the nodule, which suggests an important role of this AMP in the establishment and maintenance of the symbiosis. The aim of this thesis work was to study the role the nsLTP, AgLTP24 in the symbiosis between A. glutinosa and the bacterium Frankia alni ACN14a. The first part aimed to localize AgLTP24 in plant tissues at different stages of the symbiosis and to determine its physiological effects on the bacterial symbiont Frankia to identify possible biological functions. The second part of this work focused on the molecular response of the symbiont to AgLTP24. More broadly, since the role of nsLTPs in nitrogen-fixing symbioses is still poorly described, the identification of these peptides in nodulating and non-nodulating plants was conducted to determine their distribution and evolutionary history in nitrogen-fixing symbioses.