Characterisation of circulating HBV RNAs in chronic HBV patients

Caractérisation des ARN VHB circulants dans l'infection chronique par le VHB

• Auteur / Autrice : Alexia Paturel
• Direction : Massimo Levrero
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Infectiologie
• Date : Soutenance le 17/03/2022
• Etablissement(s) : Lyon
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale de Biologie Moléculaire Intégrative et Cellulaire (Lyon ; 1999-....)
• Partenaire(s) de recherche : établissement opérateur d'inscription : Université Claude Bernard (Lyon ; 1971-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Centre de Recherche en Cancérologie de Lyon
• Jury : Président / Présidente : Fabien Zoulim
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Massimo Levrero, Patrick Soussan, Maura Dandri, Marintha Heil, Teresa Pollicino
• Jury : Rapporteur / Rapporteuse : Patrick Soussan, Maura Dandri

Mots clés

Mots clés contrôlés

Antigènes HB

Innovation

Thérapeutique

Hépatite B

Lutte contre

Virus de l'hépatite B

Virologie médicale

Mots clés libres

Virus de l'hépatite B (VHB)

ARN VHB circulant

Standard

Intégration du VHB

Biomarqueur

Carcinome hépatocellulaire (CHC)

Hépatite B chronique

Séquençage haut débit

Hepatitis B virus (HBV)

Circulating HBV RNA

Standard

HBV integration

Biomarker

Hepatocellular carcinoma (HCC)

Next generation sequencing (NGS)

Chronic hepatitis B (CHB)

Résumé

L'infection chronique par le virus de l'hépatite B (VHB) reste un problème majeur de santé publique au niveau mondial avec 240 millions de porteurs chroniques. Les traitements actuels de l'infection chronique par le VHB ne permettent pas d'obtenir une guérison fonctionnelle, définie par la perte de l'AgHBs et permettant l'arrêt du traitement ainsi qu'une diminution du risque de complications hépatiques. Un grand nombre de nouvelles molécules thérapeutiques antivirales ciblant directement ou indirectement l'ADNccc nucléaire, l'intermédiaire de réplication servant de matrice pour la transcription de tous les ARNm viraux, afin de réduire le réservoir d'ADNccc et son activité transcriptionnelle et obtenir une guérison fonctionnelle avec une durée de traitement limitée, sont en cours d’évaluation clinique. La suppression persistante de l'ADN du VHB dans le sérum et la perte des antigènes AgHBs sont actuellement les critères d'efficacité thérapeutique pour toutes nouvelles molécules mais ne sont pas appropriés pour les patients déjà traités par des analogues nucléotidiques diminuant l'ADN viral. En outre, bien que les niveaux d'AgHBs sont prédictifs de la perte de l'AgHBs, la cinétique de réduction des taux d'AgHBs est trop lente pour être utilisée dans le contexte d'un essai clinique de courte durée. De plus, l'AgHBs peut provenir des séquences intégrées du génome viral et ne pas refléter ni le nombre de molécules d'ADNccc, ni son activité transcriptionnelle. En revanche, l'ARN VHB circulant reflète l'activité transcriptionnelle de l'ADNccc dans le foie et serait donc un bon biomarqueur non invasif pour le suivi de la maladie et l'évaluation de nouvelles molécules thérapeutiques. L'établissement d'un standard d'ARN VHB reste crucial pour le développement de tous tests de quantification de l'ARN VHB circulant. Dans ce but, nous avons conçu plusieurs lignées cellulaires clonales portant des génomes mutés du VHB. La lignée cellulaire clonale (Huh7-3D29) sécrétant des niveaux élevés d'ARN du VHB et de très faibles quantités d'ADN du VHB a été générée et caractérisée. Nous avons pu montrer que, comme déjà observé dans les sérums de patients VHB chroniques, les ARN-VHB sécrétés par le clone Huh7-3D29 sont principalement, mais pas exclusivement, des ARN de 3,5 kb et, les ARN-VHB peuvent être trouvés dans les exosomes. Des expériences de dilution en série et de reproductibilité utilisant une RT-qPCR en une étape conçue par Roche, ont montré que les surnageants des cellules Huh7-3D29 peuvent être utilisés avec les tests de quantification de l'ARN du VHB basés sur la PCR et constituent une source illimitée de standard ARN du VHB. Bien qu'il existe des preuves solides à l'appui de l'utilité clinique de la quantification des ARN VHB circulants, l'impact des transcrits chimériques virus-hôte à partir de séquences intégrées du VHB sur les niveaux d'ARN VHB circulant reste à étudier. De plus, pour comprendre l'effet des thérapies VHB sur les séquences intégrées du VHB et sur leur transcription, il sera important de quantifier à la fois les ADN et les transcrits chimériques virus-hôte. Nous avons mis en place un protocole de capture suivi par séquençage à haut débit pour l'analyse des ADN et des ARN VHB. Les résultats obtenus jusqu'à présent montrent que notre protocole de capture/séquençage peut détecter et quantifier les intégrations du VHB dans des lignées cellulaires de CHC portant des séquences intégrées du VHB (par exemple, PLC/PRF/5 et Hep3B) ainsi que dans le foie d'un porteur chronique du VHB. Dans l'ensemble, nos résultats contribuent au développement, à l'établissement et à l'interprétation de la quantification de l'ARN VHB circulant en tant que nouveau biomarqueur de l'infection chronique par le VHB.

Hepatitis B virus (HBV) infection remains a major global public health problem with 240 million chronic carriers. Current treatments for chronic HBV infection are unable to achieve a functional cure, defined by the loss of the HBsAg and allowing the treatment cessation as well as a decreased risk of liver complications. Several new therapeutic molecules that target the cccDNA, the nuclear replicative intermediate that act as template for the transcription of all viral mRNAs, with the aim of silencing or reducing the pool of cccDNA to achieve a functional cure with a finite treatment duration, are at the preclinical or early clinical stage of evaluation. A persistent suppression of serum HBV DNA and loss of HBsAg are considered the most important primary efficacy endpoints for novel molecular entities in clinical development. However, the suppression of HBV DNA in serum is not an appropriate efficacy endpoint to evaluate new HBV treatments in patients treated with DNA-decreasing nucleotide analogues. In addition, although HBsAg levels may predict HBsAg loss, the kinetic of HBsAg decline is too slow in most patients to be useful to predict functional cure within the short duration of early clinical trials. Finally, HBsAg antigens may origin from HBV sequences integrated into the host genome and do not reflect the number of cccDNA molecules and their transcriptional activity. Circulating HBV RNA reflects the transcriptional activity of cccDNA in the liver and would thus be a good non-invasive biomarker for the inactivation of cccDNA or the reduction of the cccDNA reservoir. The quantification of circulating HBV RNAs may contribute to monitor the disease, to a personalized therapeutic management, and to the evaluation of new therapeutic molecules. The establishment of an HBV RNA standard remains a challenge and is crucial for the development of all circulating HBV RNA quantification assays. To this aim we have generated several clonal cell lines carrying mutated HBV genomes. A clonal cell line (Huh7-3D29) secreting high levels of HBV RNAs and very low amounts of HBV DNAs was generated and fully characterized. We showed that, similar to what observed in patients sera, HBV-RNAs secreted from the Huh7-3D29 clone are predominantly, but not exclusively, 3.5kb RNAs and that HBV-RNAs can be found in exosomes. Serial dilution and reproducibility experiments using a one step RT-qPCR designed by Roche have shown that Huh7-3D29 supernatants are suitable for PCR-based HBV RNA quantification assays and constitutes an unlimited source of HBV RNA standard. Although there is strong evidence supporting the clinical utility of circulating HBV RNAs quantification, the impact of virus - host chimeric transcripts from integrated HBV sequences on the levels of circulating HBV RNAs remain to be studied. Moreover, to understand the effect of HBV therapies on integrated HBV sequences and on their transcription, it will be important to quantify at the same time chimeric virus - host chimeric DNAs and transcripts. We have set up a capture/NGS sequencing workflow for both HBV DNA and RNA analysis. The results obtained so far show that our capture/sequencing workflow can detect and quantify HBV integrations in HCC cell lines (e.g., PLC/PRF/5 and Hep3B) carrying HBV integrated sequences as well as in the human liver of a chronic HBV carrier. Altogether, our results contribute to the development, establishment and interpretation of serum HBV RNA as a new biomarker for chronic HBV infection.