Rôle de la phosphatase alcaline non spécifique du tissu ''TNAP'' dans la calcification des plaques d’athérosclérose

Role of tissue non-specific alkaline phosphatase ''TNAP'' in the calcification of atherosclerotic plaques

• Auteur / Autrice : Lynn Kawtharany
• Direction : David Magne, Laurence Bessueille, Kazem Zibara
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biochimie
• Date : Soutenance le 02/02/2022
• Etablissement(s) : Lyon
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Interdisciplinaire Sciences-Santé (Villeurbanne ; 1995-....)
• Partenaire(s) de recherche : établissement opérateur d'inscription : Université Claude Bernard (Lyon ; 1971-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut de Chimie et Biochimie Moléculaires et Supramoléculaires (Villeurbanne, Rhône)
• Jury : Président / Présidente : Emmanuelle Canet-Soulas
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : David Magne, Laurence Bessueille, Kazem Zibara, Marie-Hélène Lafage-Proust, Saïd Kamel, Sarah Beck-Cormier, Hervé Kempf
• Jury : Rapporteur / Rapporteuse : Marie-Hélène Lafage-Proust, Saïd Kamel, Sarah Beck-Cormier

Mots clés

Mots clés contrôlés

Phosphatase alcaline non tissu-spécifique

Phosphatase alcaline

Calcification

Innovation

Thérapeutique

Athérosclérose

Mots clés libres

Phosphatase alcaline

Athérosclérose

Inflammation

Calcification

Cellules musculaires lisses

Alkaline phosphatase

Atherosclerosis

Inflammation

Calcification

Smooth muscle cells

Résumé

Bien que la connaissance du score calcique (CAC) améliore la prédiction des événements cardiovasculaires, la situation reste assez controversée concernant l’impact local de la calcification sur la stabilité de la plaque athéroscléreuse. Le paradigme actuel suggère que les plaques très calcifiées sont plutôt stabilisées, alors que celles contenant des microcalcifications sont probablement dangereuses : en exacerbant l’inflammation des plaques, elles pourraient déclencher leur rupture. Cependant, aucune approche expérimentale n’a permis de prévenir la formation des microcalcifications dans un modèle préclinique afin de déterminer leur réel impact. La phosphatase alcaline non spécifique du tissu (TNAP), qui est la seule enzyme absolument nécessaire à la minéralisation squelettique et dentaire, est fortement suspectée de participer à la calcification des plaques. La TNAP est exprimée dans les plaques athéroscléreuses, et est également produite par le foie et libérée dans la circulation sanguine à niveaux corrélés avec le syndrome métabolique et la mortalité cardiovasculaire. Dans ce contexte nous avons cherché dans un premier temps à explorer l’implication de la TNAP dans les plaques athéroscléreuses dans le modèle murin des souris déficientes en apolipoprotéine E (ApoE). Dans un deuxième temps, nous avons cherché à étudier l’effet d’un inhibiteur de la TNAP récemment développé sous le nom de « SBI-425 » sur la calcification et le développement des plaques athéroscléreuses. La calcification des plaques athéroscléreuses a été explorée chez des souris ApoE-/- nourries avec un régime riche en gras à partir de 10 semaines d’âge et sacrifiées toutes les deux semaines, de 17 à 31 semaines dans une cohorte d’étude in-vivo (µTEP/µCT) et ex-vivo [agent fluorescent osteosense (OS)]. L’expression et l’activité de la TNAP ont été explorées dans ce modèle murin ainsi que dans des plaques de carotides humaines calcifiées et non calcifiées. La TNAP a été inhibée par une administration orale de SBI-425 à une dose de 30 mg/kg/jour chez des souris ApoE-/-, à partir de 10 semaines jusqu’à 25 semaines. En parallèle, elle a été inhibée in-vitro dans les cellules musculaires lisses vasculaires humaines (CML) avec l’inhibiteur MLS-0038949. Dans les aortes de souris ApoE-/-, ainsi que dans les carotides humaines, les calcifications des plaques sont systématiquement colocalisées avec l’activité locale de la TNAP. In-vitro, dans les CML humaines, l’inhibition de la TNAP a empêché la calcification. Chez les souris ApoE-/-, l’inhibition de la TNAP par le SBI-425 a ralenti la calcification, a réduit l’inflammation et limité le développement de la plaque (réduit l’accumulation des lipides), en association avec une réduction du taux de cholestérol et de triglycérides dans le sang. Il est important de noter que ces effets bénéfiques de l’inhibition de la TNAP se sont produits sans produire d’impact significatif sur la prise de poids, la mortalité, l’architecture osseuse, et les reins. D’autre part, l’analyse métabolomique par RMN d’extraits de foie, a identifié la phosphocholine comme un substrat probable de la TNAP hépatique, dont la déphosphorylation réduite lors de l’inhibition de la TNAP peut avoir participé à la libération réduite de cholestérol et de triglycérides dans le sang, et à l’altération ultérieure du développement de la plaque. En conclusion, nos résultats démontrent que l’inhibition systémique de la TNAP améliore l’athérosclérose, agissant à la fois sur la TNAP vasculaire et la TNAP hépatique.

Although Knowledge of the calcium score (CAC), improves the prediction of cardiovascular events, the situation remains quite controversial regarding the local impact of calcification on the stability of atherosclerotic plaque. The current paradigm suggests that highly calcified plaques are rather stabilized, whereas those containing microcalcifications are probably dangerous: by exacerbating the inflammation of the plaques, they could trigger their rupture. However, no experimental approach has been able to prevent the formation of microcalcifications in a preclinical model in order to determine their real impact. Tissue-nonspecific alkaline phosphatase (TNAP), which is the only enzyme necessary for skeletal and dental mineralization, is strongly suspected to participate in plaque calcification. TNAP is expressed in atherosclerotic plaques, and is also produced in the liver and released in the circulation at levels that correlate with metabolic syndrome and cardiovascular mortality. In this context, we first sought to explore the involvement of TNAP in atherosclerotic plaques in the mousse model of mice deficient in apolipoprotein E (ApoE)-. Second, we set out to study the effect of a recently developed TNAP inhibitor «SBI-425» on atherosclerotic plaque calcification and development. Plaque calcification was explored in 64 ApoE-/- mice fed a high fat diet from 10 weeks of age, and sacrificed every two weeks, from 17 to 31 weeks with 18F-NaF positron emission tomography and computed tomography in vivo, and with the calcium tracer osteosense ex vivo (osteosense fluorescent agent (OS)). TNAP expression and/or activity were investigated in mice and in calcified and non-calcified human carotid plaques. TNAP was inhibited in-vivo in 52 mice by oral administration of SBI-425 (30 mg/kg/day), from 10 to 25 weeks of age. In parallel, it was inhibited in-vitro in human vascular smooth muscle cells (VSMCs) with its parental compound MLS-0038949. In the aortas of ApoE-deficient mice, as well as in human carotids, plaque calcifications consistently colocalizes with local TNAP activity. In-vitro, in human VSMCs, TNAP inhibition prevented calcification. In ApoE-/- mice, TNAP inhibition by SBI-425, prevented plaque calcification, reduced plaque inflammation and limited plaque development (reduced lipid accumulation), in association with reduced levels of serum cholesterol and triglycerides. Importantly, these beneficial effects of TNAP inhibition occurred without significant impact on weight, mortality, bone architecture and kidneys. On the other hand, metabolomics analysis by RMN of liver extracts identified phosphocholine as a likely substrate of liver TNAP, whose reduced dephosphorylation upon TNAP inhibition may have participated in the reduced release of cholesterol and triglycerides into the blood, and impaired plaque development. In conclusion, our findings demonstrate that the systemic inhibition of TNAP for up to 25 weeks ameliorates atherosclerosis acting on both vascular and liver TNAP.