Homologous and heterologous interactions of the HBV capsid-forming core protein

Interactions homologues et hétérologues de la protéine centrale formant la capside du VHB

• Auteur / Autrice : Mathilde Briday
• Direction : Anja Böckmann, Lauriane Lecoq
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie moléculaire et structurale, biochimie
• Date : Soutenance le 13/12/2022
• Etablissement(s) : Lyon 1
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Interdisciplinaire Sciences-Santé (Villeurbanne ; 1995-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Molecular Microbiology and Structural Biochemistry (Lyon ; 1999-....)
• Jury : Président / Présidente : Thierry Lomberget
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Hugues de Rocquigny, Malene Jensen, Serge Bouaziz, David Durantel, Cédric Laguri
• Jury : Rapporteur / Rapporteuse : Hugues de Rocquigny, Malene Jensen

Mots clés

Mots clés contrôlés

Structure moléculaire

Dynamique moléculaire

Protéines virales

Virus de l'hépatite B

Mots clés libres

Vhb

Interaction

Rmn

Biologie structurale

Hbv

Interaction

Nmr

Structural biology

Résumé

Nous nous sommes particulièrement intéressés à la protéine core (Cp) formant la capside du virus, et à ses interactions. Cette protéine est responsable de nombreuses fonctions, que ce soit en termes de base pour les structures des futurs virions, ou encore en tant que régulateur pour certaines étapes du cycle viral. Elle est stable en solution sous forme de dimère, et sa structure comporte plusieurs sites de liaisons potentiels : le spicule, la poche hydrophobe au cœur de la protéine, et la poche de liaison aux modulateurs d’assemblage de la capside (CAMs) à l’interface des dimères. Les deux premières régions sont formées par la dimérisation de deux monomères. Afin de mieux comprendre les mécanismes d’une des étapes les plus importantes du cycle viral, à savoir l’enveloppement de la capside par les protéines d’enveloppe, nous nous sommes particulièrement intéressés aux interactions impliquant la protéine core. Tout d’abord, nous avons découvert qu’une petite molécule, le Triton X-100 (TX100), se lie dans la poche hydrophobe de la Cp. Le TX100 est un détergent utilisé lors l'étape de purification, et cette liaison, de l'ordre de la dizaine de micromolaire, induit un changement conformationnel détecté en résonance magnétique nucléaire (RMN) du solide, et plus récemment confirmé en cryo-microscopie électronique par une autre équipe. Le blocage de cette poche hydrophobe par un ligand pharmacologique pourrait potentiellement, à l’instar de certains mutants qui ont été testés en cellules, inhiber l’étape d’enveloppement de la capside et donc empêcher la formation de nouveaux virions infectieux. Cette découverte nous a mené à étudier la pharmacomodulation de ce ligand afin de comprendre l'importance de chaque fonction chimique présente sur la structure de cette molécule. Pour cela, nous avons réalisé un screening de molécules synthétisées par des collaborateurs chimistes, en utilisant la RMN en solution sur la Cp dimérique. Nous avons également évalué les paramètres thermodynamiques de ces interactions par titration calorimétrique isotherme (ITC). Finalement, nous avons docké la liaison du TX100 et de son homologue dans la poche hydrophobe. Ainsi, nous avons pu conclure sur la nécessité pour la molécule de comporter un cycle aromatique, une chaîne hydrophile de petite taille, et une chaîne aliphatique hydrophobe en position para. Des améliorations sur la structure mériteraient d'être plus approfondies pour trouver un ligand qui pourraient notamment avoir des interactions multivalentes et une affinité plus grande. Ensuite, nous nous sommes focalisés sur les interactions au niveau du spicule, et plus particulièrement entre les protéines de l'enveloppe et celle de la capside. Nous avons commencé par étudier des peptides qui inhibent cette interaction, appelés Oct1 et Oct2, et nous avons démontré qu'ils interagissaient spécifiquement au niveau du spicule. Par la suite, nous avons voulu démontrer que le domaine preS de la protéine d'enveloppe L interagissait avec la protéine core tronquée. Par RMN et ITC nous avons observé que preS se liait seulement avec la capside et pas avec le dimère, et que cette interaction était de l'ordre de quelques micromolaires. La technique de la co-expression en système acellulaire a permis de confirmer ces interactions dans des conditions proches des conditions physiologiques en termes de concentration plus proches de celles in vivo. Par RMN du solide, nous avons pu ensuite caractériser la zone de liaison entre ces deux protéines, et il semble que ce soit le spicule qui soit le plus impacté par l’interaction avec preS, même si ces résultats sont encore préliminaires à ce stade. En conclusion, nos résultats apportent des informations nouvelles sur la poche hydrophobe et sur le spicule du dimère de la protéine core.

We are particularly interested in the core protein (Cp) forming the virus capsid, and its interactions. This protein is responsible for many functions, either as a basis for the structures of future virions, or as a regulator for some steps of the viral cycle. It is stable in solution as a dimer, and its structure has several potential binding sites: the spike, the hydrophobic pocket at the core of the protein, and the binding pocket to capsid assembly modulators (CAMs) at the dimer interface. The first two regions are formed by the dimerization of two monomers. In order to better understand the mechanisms of one of the most important steps of the viral cycle, namely the envelopment of the capsid by the envelope proteins, we were particularly interested in the interactions involving the core protein. First, we found that a small molecule, Triton X-100 (TX100), binds in the hydrophobic pocket of the Cp. TX100 is a detergent used during the purification step, and this binding, of the order of ten micromolar, induces a conformational change detected by solid-state nuclear magnetic resonance (NMR), and more recently confirmed by cryo-electron microscopy by another team. The blocking of this hydrophobic pocket by a pharmacological ligand could potentially, like some mutants that have been tested in cells, inhibit the capsid envelopment step, and thus prevent the formation of new infectious virions. This discovery led us to study the pharmacomodulation of this ligand in order to understand the importance of each chemical function present on the structure of this molecule. For this purpose, we performed a screening of molecules synthesized by chemical collaborators, using solution NMR on the dimeric Cp. We also evaluated the thermodynamic parameters of these interactions by isothermal calorimetric titration (ITC). Finally, we docked the binding of TX100 and its counterpart in the hydrophobic pocket. Thus, we were able to conclude that the molecule must have an aromatic ring, a small hydrophilic chain, and a hydrophobic aliphatic chain in the para position. Further structural improvements would be required to find a ligand that could have multivalent interactions and a higher affinity. Next, we focused on the interactions at the spike level, and more particularly between the envelope and capsid proteins. We started by studying peptides that inhibit this interaction, called Oct1 and Oct2, and demonstrated that they interact specifically at the spike. Then, we wanted to demonstrate that the preS domain of the L envelope protein interacted with the truncated core protein. By NMR and ITC we observed that preS bound only to the capsid and not to the dimer, and that this interaction was of the order of a few micromolar. The technique of co-expression in cell-free system allowed us to confirm these interactions in conditions close to physiological conditions in terms of concentration closer to those in vivo. By solid-state NMR, we were then able to characterize the binding area between these two proteins, and it seems that it is the spike that is most impacted by the interaction with preS, even if these results are still preliminary at this stage. In conclusion, our results provide new information about the hydrophobic pocket and the spicule of the core protein dimer.