Recrutement des Guanylate-Binding Proteins sur Francisella novicida dans les macrophages humains

Recruitment of Guanylate-Binding Proteins to Francisella novicida in human macrophages

• Auteur / Autrice : Stanimira Valeva
• Direction : Thomas Henry
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Infectiologie
• Date : Soutenance le 07/10/2022
• Etablissement(s) : Lyon 1
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale de Biologie Moléculaire Intégrative et Cellulaire (Lyon ; 1999-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Centre International de Recherche en Infectiologie (Lyon ; 2013-....)
• Jury : Président / Présidente : Mathias Faure
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Thomas Henry, Sandrine Boisset, Alain Charbit, Petr Broz, Suzana Salcedo
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Sandrine Boisset, Alain Charbit

Mots clés

Mots clés contrôlés

Bactéries cytosoliques

Francisella novicida

Interactions hôte-agent pathogène

Microorganismes pathogènes intracellulaires

Mots clés libres

Francisella novicida

Shigella flexneri

Guanylate-Binding Proteins

Bactéries cytosoliques

Immunité inné

Inflammasomes

Francisella novicida

Shigella flexneri

Guanylate-Binding Proteins

Cytosolic bacteria

Innate immunity

Inflammasomes

Résumé

Francisella novicida est un pathogène cytosolique professionnel qui est internalisé par les cellules hôtes (macrophages, neutrophiles) par phagocytose. F. novicida échappe du phagosome grâce aux effecteurs sécrétés par un système de sécrétion de type 6 non-conventionnel. F. novicida se réplique abondamment dans le cytosol des cellules infectées. Le lipopolysaccharide (LPS) de Francisella porte une structure atypique formée par plusieurs enzymes modifiantes le LPS, ce qui permet à la bactérie d’éviter la détection par des récepteurs de l’immunité liant le LPS tels que le TLR4 ou la caspase murine pro-inflammatoire caspase-11. Dans le cytosol murin, F. novicida est détectée par le senseur d’ADN Aim2. L’orthologue humain de la caspase-11, la caspase-4, détecte faiblement le LPS de F. novicida. L’activation de la caspase-4 chez l’Homme et de Aim2 chez la souris nécessite la libération de ligand de F. novicida, processus médié par les Guanylate-Binding Proteins (GBPs).Les GBPs sont des GTPases inductibles aux interférons qui jouent un rôle clé dans les réponses immunitaires contre les pathogènes intracellulaires (virus, bactéries, protozoaires). Sept GBPs sont présentes chez l’Homme. Malgré une haute homologie de séquence, des différences subtiles parmi les GBPs se traduisent dans des divergences fonctionnelles qui sont encore largement incomprises. Une étape clé pour l’activité antimicrobienne des GBPs vers les bactéries cytosolique est la formation de complexes supramoléculaires à la surface bactérienne. De tels complexes sont formés quand GBP1 lie le LPS de Shigella ou de Salmonella et recrute ensuite GBP2, GBP3 et GBP4.Puisque F. novicida porte un LPS atypique, et au vu de l’importance des GBPs dans l’immunité anti-Francisella, notre objectif était de comprendre les mécanismes moléculaires et cellulaires contrôlant le recrutement des GBPs sur F. novicida dans les macorphages humains. F. novicida a été recouverte de GBP1 et de GBP2 dans les macrophages humains mais a échappé le recrutement de GBP3 et de GBP4. Des expériences de co-infection suggèrent que les GBPs ciblent de préférence S. flexneri en comparaison avec F. novicida. Nous avons étudié les caractéristiques de GBP1 et GBP2 promouvant le recrutement à F. novicida et nous avons montré que l’activité GDPase unique de GBP1 et requise pour initier le ciblage de GBP1 à F. novicida mais est facultative pour le recrutement sur S. flexneri. De plus, des analyses de GBP2/5 chimériques ont permis d’identifier la région centrale de GBP2 (K340-R535) comme nécessaire et suffisante pour cibler des GBPs prénylées à F. novicida. Enfin, un mutant de F. novicida ΔlpxF portant un LPS penta-acylé a été enrichi en GBP3 suggérant que les modifications du LPS contribuent à l’échappement de GBP3. Somme toute, nos résultats suggèrent que les GBPs ont une affinité différente pour les espèces bactériennes différentes, et que le répertoire des GBPs recrutées sur une bactérie cytosolique est dicté par des facteurs GBP-intrinsèques et bactériens, tels que la structure du lipid A bactérien. Peu d’espèces bactériennes sont adaptées à la vie dans le cytosol cellulaire. En tant que pathogène cytosolique, S. flexneri sécrète plusieurs effecteurs afin de bloquer des acteurs de l’immunité cytosolique, y compris les GBPs. Cette étude démontre une approche alternative : la stratégie furtive développée par F. novicida. La moindre affinité des GBPs pour F. novicida a permis de décortiquer les différents domaines qui permettent le recrutement des GBPs à la surface bactérienne. Cette étude illustre l’importance d’explorer différents modèles bactériens afin d’élargir notre compréhension des spécificités des interactions hôte-pathogène.

Francisella novicida is a professional cytosol dwelling pathogen, internalized by host cells (macrophages, neutrophils) through phagocytosis. F. novicida escapes from the phagosome using effectors secreted by an unconventional type 6 secretion system. F. novicida replicates abundantly in the cytosol of infected cells. The Francisella lipopolysaccharide (LPS) has an atypical structure shaped by several LPS modifying enzymes, allowing the bacterium to avoid detection from LPS-binding immune receptors such as TLR4 or the murine pro-inflammatory caspase-11. Instead, F. novicida is detected by the DNA sensor Aim2. The human caspase-4 (caspase-11 ortholog) detects only weakly F. novicida LPS. Both caspase-4 in human cells and Aim2 activation in murine cells requires liberation of F.novicida ligands, mediated by Guanylate-Binding Proteins (GBPs).GBPs are interferon-inducible GTPases that play a key role in cell autonomous responses against intracellular pathogens. Seven GBPs are present in humans. Despite sharing high sequence similarity, subtle differences among GBPs translate into functional divergences that are still largely not understood. A key step for the antimicrobial activity of GBPs towards cytosolic bacteria is the formation of supramolecular GBP complexes on the bacterial surface. Such complexes are formed when GBP1 binds lipopolysaccharide (LPS) from Shigella and Salmonella and further recruits GBP2, GBP3, and GBP4. Because F. novicida has an atypical LPS and given the importance of GBPs in anti-Francisella immunity, our aim was to understand the molecular and cellular mechanisms controlling recruitment of GBPs to F. novicida in human macrophages. F. novicida was coated by GBP1 and GBP2 in human macrophages but escaped targeting by GBP3 and GBP4. Coinfection experiments demonstrated that GBPs target preferentially S. flexneri compared to F. novicida. GBP1 and GBP2 features that drive recruitment to F. novicida were investigated revealing that the unique GBP1 GDPase activity is required to initiate GBP recruitment to F. novicida but facultative to target S. flexneri. Furthermore, analysis of chimeric GBP2/5 proteins identified a central region in GBP2 (K340-R535) necessary and sufficient to target prenylated GBPs to F. novicida. Finally, a F. novicida ΔlpxF mutant with a penta-acylated lipid A was targeted by GBP3 suggesting that LPS modification contributes to escape from GBP3. Altogether, our results indicate that GBPs have different affinity for different bacteria and that the repertoire of GBPs recruited onto cytosolic bacteria is dictated by GBP-intrinsic features and specific bacterial factors, including the structure of the lipid A. Few bacteria have adapted to thrive in the hostile environment of the cell cytosol. As a professional cytosol-dwelling pathogen, S. flexneri secretes several effectors to block cytosolic immune actors, including GBPs. This study illustrates a different approach of adapting to the host cytosol: the stealth strategy developed by F. novicida. The lower affinity of GBPs for F. novicida allowed to decipher the different domains that govern GBP recruitment to the bacterial surface. This study illustrates the importance of investigating different bacterial models to broaden our understanding of the intricacies of host-pathogen interactions.