Etude des protéines du cytomégalovirus humain impliquées dans l'étape d'encapsidation en vue du développement de nouvelles thérapies

Study of proteins involved in human cytomegalovirus DNA-packaging step for the development of new therapies

• Auteur / Autrice : Clotilde Muller
• Direction : Sébastien Hantz
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Immunologie, oncologie, inflammation et infectiologie
• Date : Soutenance le 09/11/2022
• Etablissement(s) : Limoges
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Ω-LIM-Biologie-Chimie-Santé (Limoges ; 2022-)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Anti-infectieux : supports moléculaires des résistances et innovations thérapeutiques (Limoges)
• Jury : Président / Présidente : Jacques Izopet
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Sébastien Hantz, Sophie Alain, Sébastien Legardinier
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Sylvie Pillet, Nicolas Lévêque

Mots clés

Mots clés contrôlés

Létermovir

Cytomégalovirus humain

Mots clés libres

Encapsidation

Complexe terminase

Résistance

DNA-packaging step

Terminase complex

Resistance

Résumé

Le cytomégalovirus humain (CMVH) est pathogène opportuniste majeur en cas d’immunodépression et représente la principale cause d’infection congénitale d’origine virale. Bien qu’efficaces, l’utilisation des molécules antivirales conventionnelles est limitée par leur toxicité et l’émergence de résistances. Face à ces constats, il est nécessaire de développer de nouvelles thérapies. L’étape d’encapsidation de l’ADN viral est essentielle à la réplication du CMVH. Les protéines impliquées dans cette étape (pUL56, pUL89, pUL51, pUL52, pUL77, pUL93, pUL104) sont des cibles privilégiées par le degré de conservation et de spécificité chez les herpèsvirus. Le développement récent du letermovir ciblant le complexe terminase (pUL56, pUL89 et pUL51) conforte ce choix. Cependant son mécanisme d’action exacte demeure inconnu et devant l’émergence de mutations à haut niveau de résistance il est nécessaire de poursuivre l’identification de nouvelles cibles thérapeutiques. Afin d’étudier le mécanisme d’action du letermovir et de mettre en évidence de nouvelles cibles au sein des protéines impliquées dans l’étape d’encapsidation, 3 axes de recherche ont été menés. (I) Etude de l’implication de pUL51 dans le mécanisme d’action du letermovir. Nous avons pu mettre en évidence son implication par la caractérisation d’une nouvelle mutation de résistance au letermovir (A95V) issue d’une souche isolée chez un patient traité. (II) Identification de nouvelles cibles thérapeutiques dans les protéines pUL51 et pUL52. Des approches bio-informatiques et expérimentales (production de virus recombinants et développement d’un inhibiteur peptidique) ont validé la présence d’un motif de type leucine-zipper dans la protéine pUL51 et des motifs de type CXXC et zinc-finger dans la protéine pUL52. Ces motifs, essentiels à la réplication virale, sont probablement impliqués dans la structurefonction de ces protéines et ainsi représentent un point de départ possible pour le développement de nouvelles thérapies. (III) Production des protéines recombinantes pUL56 et pUL89 dans l’objectif d’explorer le mécanisme d’action du letermovir. Nous avons initié des travaux de production protéiques dans un système d’expression baculovirus-cellules d’insectes. Nos résultats démontrent la production de pUL89. Cependant sa purification et la production de pUL56 nécessitent encore des étapes d’optimisation. Ainsi, ce travail de thèse a permis d’identifier de nouvelles cibles potentielles afin de faciliter le développement de nouvelles thérapies anti-CMVH et d’améliorer la compréhension du mécanisme d’action du letermovir.

The human cytomegalovirus (HCMV) is a major pathogen for immunocompromised patients and fetus in utero. Despite their efficiency, the use of conventional antivirals is limited by their toxicity and the emergence of resistance. Thus, it is necessary to develop new therapies targeting other stages of viral replication. The viral DNA-packaging step is essential for HCMV replication. Proteins involved in this step (pUL56, pUL89, pUL51, pUL52, pUL77, pUL93, pUL104) are privileged targets due to their degree of conservation and specificity in herpesviruses. The recent development of letermovir targeting the terminase complex (pUL56, pUL89 and pUL51) supports this choice. However, its mechanism of action remains unknown and in view of the emergence of mutations with a high level of resistance, it is necessary to pursue the identification of new therapeutic targets. In order to study the mechanism of action of letermovir and to identify new targets within the proteins involved in the packaging step, 3 lines of research have been carried out. (I) Study of the involvement of pUL51 in the mechanism of action of letermovir. We were able to demonstrate its involvement by characterizing a new letermovir resistance mutation (A95V) from a strain isolated from a treated patient. (II) Identification of new therapeutic targets in the pUL51 and pUL52 proteins. Bioinformatics and experimental approaches (production of recombinant viruses and development of a peptide inhibitor) validated the presence of a leucine-zipper motif in the pUL51 protein and of CXXC and zinc-finger motifs in the pUL52 protein. These motifs, essential for viral replication, are probably involved in pUL51 or pUL52 structurefunction and thus represent a possible starting point for the development of new therapies. (III) Production of recombinant proteins pUL56 and pUL89 in order to explore the mechanism of action of letermovir. We have initiated protein production in a baculovirus-insect cell expression system. Our results demonstrate the production of pUL89. However, its purification and the production of pUL56 still require optimization steps. Thus, this thesis work allowed us to identify new potential targets to facilitate the development of new anti-HCV therapies and to improve the understanding of the mechanism of action of letermovir.