Caractérisation et fonction de nouveaux complexes Trm112-MTase humains impliqués dans le processus de traduction de l'ARNm

Characterization and fonction of Trml 12-methyltransferase complexes involved in mRNA translation process

• Auteur / Autrice : Can Wang
• Direction : Marc Graille
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie
• Date : Soutenance le 08/07/2022
• Etablissement(s) : Institut polytechnique de Paris
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale de l'Institut polytechnique de Paris
• Partenaire(s) de recherche : établissement opérateur d'inscription : École polytechnique (Palaiseau, Essonne ; 1795-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Laboratoire de Biologie Structurale de la Cellule (Palaiseau ; 1975-....)
• Jury : Président / Présidente : Mark Helm
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Marc Graille, Clément Carré, Eva Kowalinski, Emmanuelle Schmitt, Frédéric Catez
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Mark Helm, Clément Carré

Mots clés

Mots clés contrôlés

ARN messagers

Biochimie

Mots clés libres

Trm112

Méthyltransférases

Mécanisme de liaison

Modification des ARN

Trm112

Methyltransferases

Binding mechanism

RNA modification

Résumé

Mon projet de thèse concerne la caractérisation structurale et fonctionnelle de complexes à activité méthyltransferase (MTase) qui modifient des facteurs (ARNs et protéines) impliqués dans le mécanisme de traduction des ARN messagers (ARNm) en protéines. Je m’intéresse tout particulièrement à l’étude de la protéine Trm112 (TRMT112 chez l’homme), une petite protéine qui agit comme un cofacteur intrinsèque de plusieurs MTases dépendantes du SAM. Ces MTases modifient l’ARN du ribosome (ARNr), des ARN de transfert (ARNt), des facteurs de la traduction mais aussi des petits ARNs. Ce projet de recherche interdisciplinaire fait appel à plusieurs techniques de biochimie et tout particulièrement (i) l’expression et la purification de protéines et ARNs, (ii) la detection de modification des ARNs par chimie analytique, (iii) la cristallographie aux rayons X de complexes multi-protéiques, (iv) la biologie cellulaire grâce à l’inactivation de gènes par CRISPR-Cas9 dans des lignées de cellules cancéreuses et (v) la purification des ARN de ces cellules. Dans un premier temps, j’ai déterminé la structure cristallographique du complexe Trm11-Trm112 de l’archée Archaeoglobus fulgidus (Af) et mis en évidence que la protéine AfTrm11 est une m2G10 tRNA MTase, dont l’activité est fortement stimulée par la protéine AfTrm112. Cette partie de mon travail a été publiée en 2020 dans la revue Nucleic Acid Research. En parallèle, j’ai aussi caractérisé le réseau d’interaction de la protéine TRMT112 humaine et identifié les protéines THUMPD3 et THUMPD2 comme nouveaux partenaires de TRMT112. Je me suis particulièrement intéressée à ces deux protéines ainsi qu’à TRMT11, un autre partenaire de TRMT112, car ces trois protéines sont composées d’un domaine THUMP fusionné au domaine MTase. J’ai réalisé des analyses fonctionnelles de ces complexes qui ont révélé que ces 3 enzymes sont responsables de la formation de la modification m2G sur différents substrats ARN. Les protéines TRMT11 et THUMPD3 sont des MTases conservées qui modifient certains ARNt aux positions 10 et 6, respectivement, tandis que THUMPD2 méthyle des petits ARNs (données non publiées). L’absence des modifications m2G catalysées par ces enzymes réduit fortement la prolifération et le niveau global de traduction dans des cellules cancéreuses. Cette étude suggère un role du réseau d’interaction de TRM112 au-delà de la traduction des ARNm puisqu’il pourrait intervenir dans la maturation des ARNm issus de l’étape de transcription de l’ADN en ARNm.

My PhD project is dealing with the structural and functional characterization of methyltransferase (MTase) complexes modifying factors (RNAs and proteins) involved in mRNA translation process. I am particularly interested in the study of Trm112 (TRMT112 in human cells), a small protein that acts as an intrinsic cofactor of many SAM-dependent MTases modifying ribosomal RNAs (rRNAs), transfer ARNs (tRNAs), translation factors but also small RNAs. This interdisciplinary research project involved techniques mainly in biochemistry including (i) protein and RNA expression and purification, (ii) analytical chemistry for RNA modification determination, (iii) X-ray crystallography of multiprotein complexes, (iv) cell biology based on CRISPR-Cas9 gene knock-out approach in cancer cell lines and (v) RNA purification from those cells. I first solved the crystal structure of archaeal Trm11-Trm112 complex from Archaeoglobus fulgidus (Af) and revealed that AfTrm11 is an m2G10 tRNA MTase, which activity is largely enhanced by complex formation with AfTrm112. This part of work has been published in 2020 in Nucleic Acid Research. Moreover, I also characterized the interaction network of human TRMT112 and identified THUMPD3 and THUMPD2 human proteins as yet unknown partners of TRMT112. I have focused on these two proteins as well as on TRMT11, another partner of TRMT112 which are all made of a THUMP domain followed by a MTase. The functional analyses that I have performed, led to the conclusion that these three enzymes are responsible for m2G modification but modify different RNA species. TRMT11 and THUMPD3 are conserved tRNA MTases methylating positions G10 and G6 on some tRNAs, while THUMPD2 methylates small RNAs (unpublished results). Loss of m2G modifications catalyzed by these enzymes strongly reduced proliferation and global translation level of cancer cells. This study also support a role of the TRMT112 interaction network beyond mRNA translation as it suggests that TRMT112-dependent RNA epitranscriptomics might play a role in mRNA maturation during DNA transcription into mRNAs.