Recherche de nouvelles sources de résistance à la verticilliose chez Medicago sp

Search for new sources of resistance to Verticillium wilt in Medicago

• Auteur / Autrice : Amir Hossein Fartash
• Direction : Martina Rickauer, Asa Ebrahimi
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Sciences agronomiques, biotechnologies agro-alimentaires
• Date : Soutenance le 24/10/2022
• Etablissement(s) : Toulouse, INPT
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Sciences de l’univers, de l’environnement et de l’espace (Toulouse)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Laboratoire Écologie fonctionnelle et environnement (Toulouse ; 2007-2023)
• Jury : Président / Présidente : Naceur Djebali
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Martina Rickauer, Asa Ebrahimi, Naceur Djebali, Julia Buitink, Diego Rubiales, Cecile Ben, Laurent Gentzbittel
• Jury : Rapporteur / Rapporteuse : Julia Buitink, Diego Rubiales

Mots clés

Mots clés contrôlés

Medicago

Légumineuses fourragères

Luzerne

Mots clés libres

Stress biotique

Changement climatique

Expression génique

Étude d'association à l'échelle du génome

Légumineuses

Medicago sativa

Résistance quantitative aux maladies

Maladies des racines

Flétrissement vasculaire

Biotic stress

Climate change

Gene expression

Genome-wide association study

Legumes

Medicago sativa

Quantitative disease resistance

Root diseases

Vascular wilt

Résumé

L'objectif de cette étude est d'explorer le contrôle génétique de la résistance de M. truncatula envers V. alfalfae dans un contexte de réchauffement climatique et de menace d'arrivée de nouveaux pathogènes par le commerce mondial. Pour obtenir une nouvelle souche de Verticillium alfalfae, des plants de luzerne présentant des symptômes de verticilliose ont été collectés lors de plusieurs sorties sur le terrain en Iran. Suite à l'isolement de champignon à partir des plantes échantillonnées, dix isolats de V. alfalfae ont été identifiés par PCR avec des amorces spécifiques à l'espèce. Sept isolats ainsi que l'isolat français V31-2 ont été étudiés pour les paramètres de croissance végétative à 20 °C, 25 °C et 28 °C. La température optimale pour la croissance radiale et la sporulation était de 25 °C suivie de 20 °C. L'analyse statistique révèle l'existence de deux groupes distincts ; l'un contenant tous les échantillons iraniens et l'autre groupe contenant l'isolat français. L'isolat iranien de V. alfalfae AF-1 a été sélectionné pour une étude de génétique d'association (GWAS) avec 242 accessions de M. truncatula de la collection HapMap afin d'identifier les loci ou les gènes impliqués dans le contrôle génétique de la résistance. Les plantes ont été inoculées aux racines avec des spores d'AF1 et les symptômes ont été notés sur une échelle de 0 à 4 pendant 4 semaines dans une chambre de culture à 25 °C (une température plus élevée par rapport aux études précédentes à 20 °C). Le score maximal des symptômes (MSS, symptôme à la fin de l'expérience) et l'aire sous la courbe de progression de la maladie (AUDPC) ont été calculés Les expériences de phénotypage ont été réalisées dans une conception en blocs augmentés (3 répétitions indépendantes composées chacune de quatre blocs indépendants) en incluant chaque fois 4 lignées (F83005.5, DZA315.14, DZA45.5 et A17) comme contrôle pour corriger les données contre les effets de bloc si nécessaire. Cinq modèles statistiques GWAS ont été testés impliquant deux modèles linéaires généraux (GLM) et trois modèles linéaires mixtes (MLM). L'analyse par Q-Q plot a montré que le MLM Q-Model est le modèle le mieux ajusté pour les deux traits (AUDPC et MSS). En utilisant le modèle le mieux ajusté, 30 locus associés à la IV résistance à l'AF1 ont été détectés par un polymorphisme de nucléotide unique (SNP) significatif pour les deux traits. Ces loci étaient tous différents de ceux identifiés précédemment avec un isolat français à 20 °C. Les régions de 10 kb entourant chaque SNP ont été explorées et les gènes situés dans cette zone ont été considérés comme des gènes candidats. Parmi 122 gènes candidats putatifs, sept gènes ont été sélectionnés pour des études d'expression. Pour évaluer expression, 12 accessions parmi les plus sensibles et les plus résistantes ont été inoculées aux racines. Les racines et les parties aériennes ont été récoltées 0,4,24 et 96 heures après l'inoculation, et les échantillons ont été regroupés en un groupe sensible et un groupe résistant pour masquer les différences individuelles entre les accessions. L'expression génique a été analysée par qRT-PCR et l'analyse des données a été effectuée par le calcul de ΔΔCT et le facteur d’induction dans les plantes inoculées par rapport aux plantes non-inoculées. Les valeurs CT ont été normalisées par rapport à la moyenne harmonique de deux gènes de référence codant pour l'actine et l'histone H3L. Les résultats de la qRT-PCR ont montré que tous ces gènes candidats étaient exprimés dans les racines et que leur expression était augmentée après inoculation dans les plantes résistantes et sensibles.

The objective of this study is to explore the genetic control of resistance in M. truncatula toward V. alfalfae in a context of global warming and the threat of arrival of new pathogens by global trade. To obtain a new strain of Verticillium alfalfae, alfalfa plants with symptoms of Verticillium wilt were collected during several field trips in Iran. Following fungal isolation from the sampled plants, ten V. alfalfae isolates were identified by PCR with species-specific primers., Seven isolates along with the French isolate V31-2 were studied for vegetative growth parameters at 20 °C, 25 °C and 28 °C. Optimum temperature for radial growth and sporulation was 25 °C followed by 20 °C. Statistical analysis reveals the existence of two distinct groups; one containing all Iranian samples and the other group containing the French isolate. The Iranian V. alfalfae isolate AF-1 was selected for a Genome wide association study (GWAS) with 242 M. truncatula accessions from the HapMap collection to identify loci or genes involved in the genetic control of resistance. Plants were root-inoculated with spores of AF1 and symptoms were scored on a scale from 0 to 4 during 4 weeks in a growth chamber at 25 °C (a higher temperature compared to previous studies at 20 °C). Maximum symptom score (MSS, symptom at the end of the experiment) and Area under disease progress curve (AUDPC) were computed. The phenotyping experiments were performed in an augmented block design (3 independent repeats each of which consisted of four independent blocks) while 4 lines (F83005.5, DZA315.14, DZA45.5, and A17) were used as check lines to correct the data against block effects if necessary. Five GWAS statistical models were tested involving two General Linear models (GLM) and three Mixed Linear Models (MLM). Analysis by Q-Q plot showed that the MLM QModel is the best-fitted model for both traits (AUDPC and MSS). Using the best-fitted model, 30 loci associated to resistance towards AF1 were detected through significant Single Nucleotide Polymorphism (SNP) for the two traits. These loci were all different from those identified previously with a French isolate at 20 °C. The regions of 10 kb surrounding each SNP were explored and genes located in this area were considered VI as candidate genes. Among 122 putative candidate genes, seven genes were selected for expression studies. To evaluate their expression, 12 of the most susceptible and the most resistant accessions were root-inoculated. Roots and aerial parts were harvested 0, 4, 24 and 96 hours after inoculation, and the samples were pooled in a susceptible and a resistant group to mask the individual differences among accessions. Gene expression was analyzed by qRT-PCR and data analysis was performed through calculation of ΔΔCT and fold change of expression in inoculated plants versus mockinoculated plants. CT values were normalized against the harmonic mean of two reference genes encoding Actin and Histone H3L. The qRT-PCR results showed that all selected candidate genes were expressed in roots and that their expression was increased after inoculation in both resistant and susceptible plants. The induction was consistently higher and more durable in resistant plants compared to susceptible ones, confirming the involvement of the identified loci in resistance. In conclusion, the results indicate that a simple shift in temperature combined with a new pathogen strain entirely changes the architecture of genetic control of resistance to the pathogen. This should be a serious warning to breeders, and policy makers and institutions that control the exchange of plant material.