Isolement et caractérisation d'anticorps monoclonaux humains bloquant la transmission de Plasmodium falciparum

Isolation and characterization of human monoclonal antibodies blocking Plasmodium falciparum transmission

• Auteur / Autrice : Axelle Amen
• Direction : Pascal Poignard
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Virologie microbiologie immunologie
• Date : Soutenance le 16/12/2022
• Etablissement(s) : Université Grenoble Alpes
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale chimie et science du vivant (Grenoble ; 199.-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut de biologie structurale (Grenoble)
• Jury : Président / Présidente : Isabelle Tardieux
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Mireia Pelegrin-Zurilla, Bertrand Huard
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Rogerio Amino, Dorian Mcilroy

Mots clés

Mots clés contrôlés

Plasmodium falciparum

Immunologie

Anticorps monoclonaux

Microbiologie

Mots clés libres

Microbiologie

Anticorps bloquant la transmission

Anticorps monoclonaux humains

Vaccin

Immunologie

Plasmodium Falciparum

Immunology

Transmission blocking antibodies

Plasmodium Falciparum

Vaccine

Microbiology

Human monoclonal antibodies

Résumé

Parmi les personnes naturellement exposées à Plasmodium falciparum (Pf) et vivant en zone d’endémie, certaines développent naturellement des anticorps capables d'inhiber le développement du parasite dans le moustique, réduisant ou bloquant ainsi la transmission à l'homme. Bien que quelques protéines du stade sexuel de Pf aient été identifiées comme cibles de ces anticorps, les travaux récents de Stone et al. ont démontré l'existence de protéines encore non décrites associées à l'activité de réduction de la transmission (ART). La découverte de nouvelles cibles antigéniques des anticorps réducteurs de transmission (AcART) pourrait contribuer au développement de vaccins bloquant la transmission, efficaces pour éradiquer le paludisme. L'objectif principal de mon projet de thèse était donc d'identifier de nouveaux antigènes en utilisant une approche de vaccinologie inverse 2.0, par l'isolement, à partir de donneurs sélectionnés, d'anticorps monoclonaux (Acm) ayant une forte activité de réduction de la transmission. Pour se faire, nous avons conçu un pipeline innovant pour l'isolement des AcART à partir des cellules B mémoires (CBM) d'individus sélectionnés infectés de façon chronique par Pf. Dans une première approche, nous avons choisi d'isoler les CBM en fonction de leur capacité à se lier au parasite entier, ici sous la forme de gamètes vivants. Comme deuxième méthode, nous avons choisi d'activer les CBM dans un milieu de culture adapté et de cribler les immunoglobulines contenues dans le surnageant de culture cellulaire pour leur liaison aux protéines des gamét(ocyt)es en ELISA. Dans les deux méthodes, après la première sélection, les Acm ont été clonés, produits et testés pour leur liaison aux gamètes en immunofluorescence de surface et pour leur activité fonctionnelle par Standard Membrane Feeding Assay (SFMA).La première approche n'a été réalisée qu'à titre expérimental, en utilisant les cellules mononuclées sanguines d'un donneur possédant des anticorps contre les protéines du stade sexuel de Pf, mais sans ART sérique. Un Acm ciblant les gamètes a pu être isolé mais aucun AcART. Ces résultats limités suggèrent que l'approche pourrait produire des anticorps d'intérêt, mais des expériences supplémentaires seraient nécessaires. En revanche, les cellules mononucléaires du sang périphérique d'un donneur sélectionné pour sa forte ART sérique et pour lequel il avait été démontré la présence d’AcART dirigés contre de nouvelles cibles ont été utilisées pour la deuxième approche. Sept AcART ont été isolés ; parmi eux, 4 se sont avérés être dirigés contre des protéines connues pour être associées à l’ART: Pfs230 et Pfs48/45. Sur les trois autres Acm, l'un s'est avéré être polyréactif mais, fait intéressant, les deux autres semblaient reconnaître des antigènes non caractérisés jusqu'à présent. Dans l'ensemble, les résultats ont validé l'approche adoptée et des travaux supplémentaires sont en cours pour identifier les antigènes potentiellement nouveaux associés à l’ART et reconnus par les deux derniers Acm.Grâce à l'approche d'activation, nous avons également isolé des anticorps sans ART, l'un d'entre eux, l'Acm B1E11K, présentant un profil de liaison intéressant. Cet anticorps reconnaît des protéines de différents stades du parasite (notamment Pfs230, Pf11.1, RESA, RESA3 et LSA3), par la reconnaissance de motifs riches en glutamate. B1E11K se lie de manière préférentielle aux répétitions EENVEE de RESA et RESA3. Les expériences de cristallographie ont montré que lorsque 2 Fabs se lient à des motifs répétés adjacents, ils s'engagent dans des interactions homotypiques. Il est intéressant de noter que certains des résidus impliqués dans ces interactions homotypiques sont acquis par hypermutation somatique, ce qui démontre un avantage sélectif. Cette observation apporte un nouvel éclairage sur les réponses immunitaires aux motifs répétés que l'on trouve couramment dans les protéines de Pf.

Among people naturally exposed to Plasmodium falciparum (Pf) in endemic areas some naturally develop antibodies that are capable of inhibiting the development of the parasites in the mosquito, thus reducing or blocking further transmission to human. Although a few Pf sexual stage proteins have been identified as targets for these antibodies, recent work by Stone et al. demonstrated the existence of yet undescribed transmission reducing activity-associated proteins. The discovery of novel antigenic targets for transmission reducing antibodies (TRAbs) could help the development of effective transmission blocking vaccines to eradicate malaria. The main purpose of my Ph.D. thesis project was thus to identify such new antigens using a reverse vaccinology 2.0 approach, through the isolation, from selected donors, of monoclonal antibodies (mAbs) with strong transmission reducing activity (TRA). For this purpose, we designed an innovative pipeline for isolation of TRAbs from memory B cells (MBCs) of selected individuals chronically infected by Pf. As a first approach, we opted for isolating MBCs based on their ability to bind to the whole parasite, here in the form of live gametes. We reasoned that this would indicate specificity for gamete surface proteins, some of which being potentially involved in TRA. As a second method we chose to activate MBCs in a high throughput format and screen immunoglobulin-containing supernatants for binding to gamet(ocyt)e proteins in an ELISA format. In both methods, following the first selection, mAbs were cloned, produced and tested further for binding to gametes in surface immunofluorescence and for functional activity in Standard Membrane Feeding Assay (SFMA).The first approach was only performed as a proof of concept experiment, using peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) from a donor with antibodies to Pf sexual stage proteins but no serum TRA. One mAb targeting gametes was potentially isolated but no TRAb. The limited results suggested that the approach could yield antibodies of interest but we could not conclude on its effectiveness, and additional experiments would be necessary. In contrast, PBMCs from a selected donor with strong serum TRA and evidence of TRAbs directed at novel targets were used for the second approach. Seven TRAbs were isolated; among them, 4 were found to be directed against well-known TRA-associated proteins: Pfs230 and Pfs48/45. Of the 3 remaining Abs one was found to be polyreactive, but interestingly the two others appeared to recognise so far not characterised antigens. Overall, the results validated the approach taken and further work is needed to identify the potentially novel TRA-associated antigens recognized by the 2 latter mAbs.Through the activation approach we also isolated antibodies with no TRA, one of those, the B1E11K mAb, having an interesting binding profile. This mAb, although not being able to reduce transmission, was shown to recognize proteins from various stages of the parasite (notably Pfs230, Pf11.1, RESA, RESA3 and LSA3), through the recognition of glutamate-rich motifs. B1E11K was found to preferentially bind RESA and RESA3 EENVEE repeats and structural determination showed that when 2 Fabs bind to adjacent repeats they engage in homotypic interactions. Interestingly, some of the residues involved in these homotypic interactions are acquired through somatic hypermutation demonstrating a selective advantage. This observation brings new insights into immune responses to repeated motifs commonly found in Pf proteins.