Caractérisation structurale et fonctionnelle de l'éditosome APOBEC1 et de la modification des ARNt par METTL6

Structural and Functional Characterization of the APOBEC1 Editosome and of tRNA Modification by METTL6

• Auteur / Autrice : Philipp Throll
• Direction : Eva Kowalinski
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie structurale et nanobiologie
• Date : Soutenance le 09/12/2022
• Etablissement(s) : Université Grenoble Alpes
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale chimie et science du vivant (Grenoble ; 199.-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : European molecular biology laboratory (Grenoble, Isère, France ; 1976-....)
• Jury : Président / Présidente : Winfried Weissenhorn
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Andrés Palencia, Orsolya Barabas
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Ramesh Pillai, Carine Tisné

Mots clés

Mots clés contrôlés

ARN -- Édition

Mots clés libres

Édition des ARN

Apobec1

Mettl6

Epitranscriptomic

Modification des ARN

Apobec1

Epitranscriptomics

RNA editing

RNA Modification

Mettl6

Résumé

L’épitranscriptomique correspond à de changements ciblés dans la séquence d’ARN, soit par la production de nucléotides non-canoniques (modifications de l’ARN) ou par le changement de la séquence de l’ARN (édition de l’ARN). Au cours des dernières années, une grande variété de différents processus de modifications et d’édition des ARN ont été découvert, ayant un rôle dans tous les domaines du vivant et affectant tous les types d’ARN. Ces processus sont impliqués dans beaucoup de différents mécanismes de régulation des gènes et de la traduction des ARN. Malgré leur importance dans la biologie des ARN, seul quelques événement d’épitranscriptomique ont été étudiées extensivement et la majorité de ces modifications sont très peu comprises.Lors de cette thèse, j’ai étudié deux procédés d’épitranscriptomique : la génération de 3-méthylcytosine (m³C) sur les ARNt par la méthyltransférase METTL6 et l’édition de cytosine en uridine par le complexe APOBEC1-éditosome.Chez l’humain, certains ARNm sont édités par APOBEC1 une cytidine désaminase qui cible spécifiquement les cytidines et les édite en uracile. Cette édition peut générer différents isoformes protéiques et peut réguler la traduction, la localisation et la stabilité des ARNm. APOBEC1 est la sous-unité catalytique d’un complexe mal défini appelé l’éditosome APOBEC1, dont l’exact composition, la régulation et le ciblage spécifique sont encore peu compris. De plus, APOBEC1 peut commencer à agir comme un mutateur de l’ADN avec une implication dans certains cancers. Par la caractérisation de l’interaction des sous-unités de l’éditosome entre-elles et avec l’ARN, je voulais comprendre la fonction du complexe APOBEC1-éditosome. Par conséquent, j’ai entrepris de purifier le complexe APOBEC1-éditosome et de caractériser la structure ce complexe. En raison du comportement d’agrégation des protéines, qui empêche de telles études structurales, j’ai décidé de réaliser la caractérisation biochimique des composants de l’éditosome individuellement.La modification 3-méthylcytosine (m³C) est présente dans de nombreuses espèces eucaryotes, mais est absente chez les procaryotes. Chez l’humain, une petite famille appartenant aux méthyltransférases dépendant des SAM de classe I génère la modification 3-méthylcytosine sur différents ARNt. METTL6, un membre de cette famille, modifie spécifiquement les ARNt de sérine cytosolique. L’activité génératrice de m³C de METTL6 sur les ARNt est impliqué dans la régulation de la pluripotence et la croissance cellulaire et son expression est surrégulée dans certains types de cancer, en faisant de cette protéine une cible thérapeutique prometteuse. Actuellement, on ne sait pas comment METTL6 reconnait ses ARNt cibles et comment il les différencie des ARN non-cibles. Pour répondre à ces questions, j’ai entrepris de caractériser la structure de METTL6, ainsi que de caractériser son interaction avec l’ARNt. En conséquence, j’ai résolu la structure cristalline de METTL6, ainsi que la structure par microscopie Cryo-EM de l’ARNt lié à METTL6 en complexe avec la seryl-ANRtSynthétase (SerRS) qui occupe le rôle de cofacteur complémentaire.

Epitranscriptomics refers to targeted changes in the RNA sequence, either by the production of non-canonical nucleotides (RNA modification) or by changing the encoded sequence (RNA editing). Over the recent years, a great variety of different RNA modification and RNA editing events has been discovered, acting across all domains of live and affecting all types of RNA. These processes are involved in many different layers of gene and translation regulation on the RNA level. Despite their relevance for RNA biology, only a few epitranscriptomic processes have been researched in detail and their majority is still poorly understood.In my thesis, I studied two different epitranscriptomic processes: Cytosine to uridine editing by the APOBEC1-editosome and the generation of 3-methylcytosine (m³C) in tRNAs by the methyltransferase METTL6.In humans, certain mRNAs are edited by the cytidine deaminase APOBEC1 which targets specific cytidines and edits them to uracil. This editing can generate different protein isoforms and regulates the translation, localization and stability of mRNAs. APOBEC1 is the catalytic subunit of an ill-defined assembly called the APOBEC1-editosome, the exact composition, regulation and target specificity of which are only poorly understood. Furthermore, APOBEC1 can begin to act as a DNA mutator with an involvement in cancer.By characterizing the interaction of its subunits with each other and with RNA, I wanted to understand the function of APOBEC1-editosome. Therefore, I set out to purify the APOBEC1-editosome and structurally characterize the complex. Due to the aggregation behaviour of the proteins however, which prevented such structural studies, I opted to carry out a biochemical characterization of the individual editosome components.3-Methylcytosine (m³C) can be found across multiple eukaryote species but not in prokaryotes. In humans, a small family of class-I SAM dependent methyltransferases generates m³C on different sets tRNAs. METTL6, a member of this family, specifically modifies cytosolic serine tRNAs. The m³C-generating activity of METTL6 on tRNA is involved in the regulation of pluripotency and cell growth and its expression is upregulated in certain cancer types, making it a promising drug target.Currently it is unknown how exactly METTL6 recognizes its target RNA and how it distinguishes them from other non-substrate tRNAs. In order to respond to this question I set out to structurally characterize METTL6 and its interaction with tRNA. As result, I solved the crystal structure of METTL6 as well as the cryo-EM structure of the tRNA bound METTL6 in complex with seryl-tRNA synthetase (SerRS) which acts as METTL6 complementing co-factor.