Caractérisation structurale de HSulf par microscopie électronique, cristallographie et RMN

Structural characterization of HSulf by electron microscopy, crystallography and NMR

• Auteur / Autrice : Yoann Cretinon
• Direction : Romain Vivès
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie structurale et nanobiologie
• Date : Soutenance le 23/11/2022
• Etablissement(s) : Université Grenoble Alpes
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale chimie et science du vivant (Grenoble ; 199.-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut de biologie structurale (Grenoble)
• Jury : Président / Présidente : Sylvie Ricard-Blum
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Véronique Rossi
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Sylvie Ricard-Blum, Fabien Lecaille

Mots clés

Mots clés contrôlés

Enzymes -- Analyse

Résonance magnétique nucléaire

Cristallographie

Microscopie électronique

Héparane sulfate

Mots clés libres

HSulf

Structure

Milieu de marquage

Acides aminés méthyles

HSulf

Structure

Labeling medium

Methyl amino acids

Résumé

Les Héparanes Sulfate se lient à un large éventail de protéines de signalisation, modulant ainsi leur disponibilité et leur structure. Ces interactions se produisent par l'intermédiaire de motifs de sulfatation spécifiques présents au sein du polysaccharide. La structure de ces polysaccharides peut être régulée par différentes enzymes, dont les sulfatases extracellulaires (famille des Sulfs). Les Sulfs catalysent l'élimination sélective des groupements 6-O-sulfate, et sont donc impliquées dans de nombreux processus physiopathologiques. Ces enzymes se composent d’un domaine catalytique (CAT) contenant le site actif et d’un domaine basique hydrophile (HD) responsable de la liaison aux HS. Malgré un intérêt croissant pour ces enzymes, la structure des Sulfs reste inconnue. Dans ce contexte, ce projet a visé à réaliser une étude structurale de la protéine humaine HSulf-2 en utilisant une approche de biologie structurale combinant cristallographie, microscopie électronique et RMN.HSulf-2 étant une protéine de grande taille et devant être exprimée en cellules eucaryotes (HEK 293) pour être active, une stratégie de marquage spécifique des acides aminés méthyles a été retenue pour les études RMN. A ce jour, il n’existe pas de milieux de culture commerciaux pour le marquage spécifique de protéines exprimées en cellules de mammifères. Un des premiers objectifs a donc été de développer ce type de milieu et d’optimiser sa composition et ses conditions d’utilisation afin de permettre un marquage spécifique 13CH3 des acides aminés portant un groupement méthyle. Ce milieu a été validé en réalisant le marquage et l’acquisition de spectres 2D d’une protéine modèle : Hsp90 N-terminal. En revanche, il a été constaté que le milieu développé entrainait une perte de rendement protéique d’environ 25 % (comparé au milieu de culture standard), corrélé à une croissance cellulaire réduite.Ce milieu a ensuite été utilisé pour exprimer le variant protéique HSulf-2 ΔHD (correspondant au domaine CAT de l’enzyme) mais les spectres obtenus étaient non exploitable. L’hypothèse retenue est que l’enzyme HSulf-2 présente une trop grande flexibilité et/ou une trop faible structuration pour générer des spectres RMN résolus.En parallèle de ces analyses, des expériences en cryo-EM ont permis l’acquisition de deux jeux de données et la production de deux modèles structuraux résolus entre 4 Å et 7 Å. Bien que ces modèles n’autorisent pas un calcul de la structure, ils permettent tout de même d’identifier l’organisation tridimensionnelle d’un certain nombre de structures secondaires, dont certaines pourraient être calculées, et sont représentatifs de la protéine. De plus, grâce aux résultats obtenus au cours de cette thèse une nouvelle stratégie en deux étapes a pu être dessinée pour la caractérisation de HSulf-2 par cryo-EM.Enfin, des essais de cristallogenèse ont été réalisés sur trois constructions de la protéine cible, HSulf-2 ΔSG, HSulf-2 ΔHD et HSulf-2 ΔHDc, pour lesquelles la chaîne de GAG présente sur le domaine HD (HSulf-2 ΔSG), ou des régions non structurées (HSulf-2 ΔHD et HSulf-2 ΔHDc), ont été tronquées. Ces tests ont révélé des cristaux non-exploitables ou aucun cristal, mais la qualité prometteuse des échantillons, et les concentrations atteintes, laissent imaginer de nombreuses optimisations.Ces travaux ont permis d’identifier quelles méthodes d’analyse structurale seront les plus appropriées pour l’étude de cette enzyme, et quels points d’optimisation devront être étudiés pour obtenir une structure haute résolution de l’enzyme. Cette thèse a, par ailleurs, permis de développer une nouvelle stratégie de marquage pour les protéines exprimées en cellules de mammifère HEK 293. Ce milieu nécessite encore quelques optimisations, notamment dans l’incorporation de résidus deutérés, afin d'accroître la résolution des spectres acquis. Il ouvre néanmoins des perspectives importantes pour l’étude par RMN de protéines complexes exprimées en système mammifère.

Heparan Sulfate binds to a wide variety of signaling proteins, modulating their availability, stability and structure. These interactions are carried out through saccharide motifs of specific sulfation patterns, present within the polysaccharide. The structure of the polysaccharide can be regulated by different enzymes, including extracellular sulfatases of the Sulf family. Sulfs catalyze the selective removal of 6-O-sulfate groups, participating in the recognition of many proteins, and are thereby involved in many pathophysiological processes, such as cancer. These enzymes feature a catalytic domain (CAT) containing the active site, and a basic hydrophilic (HD) domain responsible for binding to HS. Despite growing interest for this family of enzymes, the structure of Sulfs remains unknown. In this context, this project aimed to determine the structure of the human protein HSulf-2, using an integrative structural biology approach combining crystallography, electron microscopy and NMR.HSulf-2 is a large protein and needs to be express in eukaryotic cells (HEK 293) to be active; thus, a 13CH3 methyl specific labeling strategy was chosen to study this enzyme by NMR. To date, there is no commercial medium for specific isotopic labeling of proteins expressed in mammalian cells. So, one of the first objectives of this thesis was to develop this type of medium and to optimize its composition in order to allow a specific 13CH3 labeling of methyl bearing amino acids. This medium was validated by the labeling and the acquisition of 2D spectra of a model protein: Hsp90 N-terminal. Noteworthy, the new medium was found to cause a loss of protein yield of approximately 20 - 25 % (compared to standard culture medium for HEK 293 cells), correlated to a reduced cell growth.This medium was then used to express the protein variant HSulf-2 ΔHD (corresponding to the CAT domain of the enzyme) but the spectra obtained were not usable. The hypothesis proposed is that the enzyme HSulf-2 exhibits too much flexibility and/or too little structuration to generate exploitable NMR spectra.In parallel with these analyses, cryo-EM experiments allowed the acquisition of two data sets and the production of two structural models resolved between 4 Å and 7 Å. Although these models do not allow a calculation of the structure, they make possible to identify the 3D organization of a certain number of secondary structures, some of which could be calculated, and are representative of the protein. Moreover, thanks to the results obtained during this thesis, a new two-step strategy could be designed for the characterization of HSulf-2 by cryo-EM.Finally, crystal growth assays were performed on three constructs of the target protein, HSulf-2 ΔSG, HSulf-2 ΔHD and HSulf-2 ΔHDc, for which the GAG ​​chain present on the HD domain (HSulf-2 ΔSG ), or undefined regions (HSulf-2 ΔHD and HSulf-2 ΔHDc), were truncated. These tests revealed non-exploitable crystals or no crystals, but the promising quality of the samples, and the concentrations used, suggest many optimizations.This work provided important information on the structuration of HSulf-2, made it possible to identify which methods of structural biology will be the most appropriate for the study of this enzyme, and which points of optimization should be studied to obtain a high resolution structure of the enzyme. During this thesis, we also proposed a new labeling strategy for proteins expressed in mammalian cells. Even if this medium still requires some optimizations, in particular for the incorporation of deuterated residues in order to increase the resolution of the acquired spectra; it definitively opens new perspectives for NMR studies of proteins expressed in mammalian expression system.