Etude fonctionnelle et structurale de la protéine d'immunité Llp du phage T5

Functional and structural study of Llp, the immunity protein of Phage T5

• Auteur / Autrice : Séraphine Crassac Degroux
• Direction : Cécile Breyton
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie structurale et nanobiologie
• Date : Soutenance le 29/11/2022
• Etablissement(s) : Université Grenoble Alpes
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale chimie et science du vivant (Grenoble ; 199.-....)
• Partenaire(s) de recherche : Equipe de recherche : Groupe Membrane et pathogènes (Grenoble)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut de biologie structurale (Grenoble)
• Jury : Président / Présidente : Christelle Breton
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Adeline Goulet, Eva Pebay-Peyroula
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Pascale Boulanger, Sophie Zinn-Justin

Mots clés

Mots clés contrôlés

Interactions protéine-protéine

Protéines membranaires

Résistance aux bactériophages

Mots clés libres

Bactériophages

Protéines membranaires

Interactions protéine-Protéine

Biologie Structurale

Liporpotéine Llp

FhuA-Pb5

Protein-Protein interaction

Bacteriophages

Membrane protein

Structrural biology

Lipoprotein Llp

FhuA-Pb5

Résumé

Les bactériophages ou phages sont des virus qui infectent les bactéries. Ils représentent l’entité biologiques les plus abondantes de la planète et sont présents dans tous les biotopes. Le phage T5 est un phage strictement lytique qui appartient à la famille des Siphoviridae et qui infecte E. coli. L'infection par le phage T5 est déclenchée par la reconnaissance de l'hôte grâce à pb5, la protéine de liaison au récepteur (RBP), qui se lie à FhuA, transporteur de la membrane externe de E. coli. Cette interaction déclenche la perforation de la paroi bactérienne et l’injection de l'ADN viral dans le cytoplasme de l'hôte. Cette première étape de l'infection est suivie par la réplication virale puis la libération des nouveaux virions. Pendant cette période de vulnérabilité, T5 protège la nouvelle usine virale d'une surinfection par la production d’une lipoprotéine périplasmique, Llp, qui cible le feuillet interne de la membrane externe, se lie à FhuA et l'inactive. La principale fonction biologique de Llp est probablement d'empêcher l'inactivation des virions par les FhuA présente dans les débris des cellules lysées, augmentant ainsi leurs chances d'infecter un nouvel hôte. Pendant ma thèse, nous avons résolu la structure du complexe FhuA-pb5 par microscopie électronique à une résolution de 2,4 Å. La structure de pb5 partage des homologies avec d’autres protéines de phage dans sa partie proximale seulement. La structure du complexe FhuA-pb5 montre que l’interaction entre FhuA et pb5 est principalement due à un réseau de liaisons hydrophobes. Nous avons également résolu la structure de Llp par RMN pour la forme soluble (Sol-Llp), révélant un repliement principalement en feuillet bêta avec une boucle flexible. Cette structure est une nouvelle structure de protéine de phage. De plus, j’ai étudié le complexe FhuA-Llp avec diverses méthodes biochimiques et biophysiques permettant de définir un KD de 1,5 mM pour Sol-Llp et une estimation de KD pour la protéine acylé de 20 µM, ce qui implique de l’acylation joue un rôle important dans la formation du complexe. La titration de Sol-Llp par FhuA en RMN montre des perturbations d’intensité et de déplacement chimique pour les résidus 12 à 24, et 51 à 54. Des mutants de ces résidus ainsi que des résidus 39 à 45 - non accessibles en RMN - confirment l’importance de ces résidus dans l’interaction avec FhuA, les protéines mutantes étant incapables de protéger la cellule d’une infection à T5 contrairement à la protéine sauvage.

Bacteriophages or phages are viruses that infect bacteria. They are the most abundant biological entity on the earth and are present in all biotopes. Phage T5 is a strictly lytic phage that belongs to the family Siphoviridae and infects E. coli. Infection by the T5 phage is triggered by host recognition through the receptor binding protein (RBP) pb5, which binds to the E. coli outer membrane transporter FhuA. This interaction triggers the perforation of the bacterial wall and the injection of viral DNA into the host cytoplasm. This first stage of infection is followed by viral replication and the release of new virions. During this vulnerable period, T5 protects the new viral factory from superinfection by producing a periplasmic lipoprotein, Llp, which targets the inner leaflet of the outer membrane, binds to and inactivates FhuA. The main biological function of Llp is probably to prevent the inactivation of virions by FhuA present in the debris of lysed cells, thus increasing their chances of infecting a new host. During my thesis, we solved the structure of the FhuA-pb5 complex by electron microscopy at a resolution of 2.4 Å. The structure of pb5 shares homologies with other phage proteins only in its proximal part. The structure of the FhuA-pb5 complex shows that the interaction between FhuA and pb5 is mainly due to a network of hydrophobic bonds. We also solved the structure of Llp by NMR for the soluble form (Sol-Llp), revealing a predominantly beta-sheet folding with a flexible loop. This structure is a novel phage protein structure. In addition, I studied the FhuA-Llp complex with various biochemical and biophysical methods to define a KD of 1.5 mM for Sol-Llp and an estimated KD for the acylated protein of 20 µM, which implies that acylation plays an important role in the formation of the complex. NMR titration of Sol-Llp by FhuA shows intensity and chemical shift perturbations for residues 12-24, and 51-54. Mutants of these residues as well as residues 39-45 - not accessible by NMR - confirm the importance of these residues in the interaction with FhuA, with the mutant proteins being unable to protect the cell from T5 infection in contrast to the wild type.