Etude des fonctions vasculaires des Bone Morphognetic Proteins 9 et 10 à l’aide de modèles murins transgéniques

Deciphering the vascular functions of Bone Morphogenetic Protein 9 and 10 using knock-out mouse models

• Auteur / Autrice : Martina Rossi
• Direction : Emmanuelle Tillet-Barret
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie cellulaire
• Date : Soutenance le 09/11/2022
• Etablissement(s) : Université Grenoble Alpes
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale chimie et science du vivant (Grenoble ; 199.-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Laboratoire biologie et biotechnologie pour la santé (Grenoble, Isère, France ; 2021-....)
• Jury : Président / Présidente : François Boucher
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Philippe Huber, Ulrich Valcourt
• Jury : Rapporteur / Rapporteuse : Delphine Meynard, Ebba Brakenhielm

Mots clés

Mots clés contrôlés

Souris transgéniques

Néovascularisation

Mots clés libres

BMP9 et BMP10

Fonctions vasculaires

Murins transgéniques

Angiogenèse

BMP9 and BMP10

Vascular functions

Knock-Out mouse models

Angiogenesis

Résumé

BMP9 et BMP10 sont deux ligands spécifiques du récepteur ALK1 exprimé principalement sur les cellules endothéliales. Des mutations dans la voie de signalisation BMP9/BMP10/ALK1/ENG sont liées à des pathologies vasculaires, notamment la maladie de Rendu-Osler et l'hypertension artérielle pulmonaire (HTAP). BMP9 est exprimé par le foie, tandis que la source principale de la BMP10 est le cœur. Cependant, BMP10 est aussi exprimé par le foie, où il pourrait former un hétérodimère BMP9/10 circulant responsable de l’activité d’ALK1 activité sur les cellules endothéliales. L'objectif de ma thèse était de caractériser les rôles de BMP9 et BMP10 dans l'homéostasie cardiovasculaire à l’aide de modèles de souris déficients pour BMP9 et/ou BMP10 et de discriminer les fonctions cardiaques et hépatiques de BMP10. Alors que l’expression de BMP9 a été invalidée de manière constitutive, la délétion de BMP10 a dû être générée à l'aide du promoteur inductible ubiquitaire Rosa26-CreERT2, afin de contourner la létalité embryonnaire.Nos résultats montrent que, alors que les souris adultes iKO Bmp10 n'ont pas développé de défauts cardiovasculaires majeurs, la délétion concomitante des deux ligands (double-KO Bmp9-/- R26CreERT2 Bmp10lox/lox) entraîne d’importants défauts vasculaires, montrant que les deux ligands participent à l'homéostasie vasculaire. Chez les animaux plus jeunes, nous avons initialement identifié que les souris Rosa26 CreERT2 BMP10 iKO injectées par tamoxifène présentaient des défauts d'hématopoïèse. Malheureusement, nous avons démontré que le phénotype observé était un artefact induit par la toxicité de CreERT2. En effet, des souris CreERT2 dépourvus d'un allèle floxé developpent un phénotype similaire à celui des Rosa Cre BMP10 iKO. Dans la moelle osseuse de ces animaux, le réseau vasculaire est fortement désorganisé associés à une réduction des cellules hématopoïétiques. Notre travail a mis en lumière l'importance d'utiliser les bons contrôles lorsque l'on travaille avec des modèles de souris dépendantes de la Cre inductible. Par ailleurs, dans le contexte de la lymphangiogenèse postnatale, nous avons confirmé un rôle de BMP10 montrant une augmentation et dilatation des vaisseaux LYVE1+ en l'absence de BMP10, défaut qui n'est pas dû à la toxicité de la CreERT2.Enfin, nous avons prouvé l'importance de BMP9 et BMP10 dans le développement vasculaire en utilisant le modèle d'angiogenèse de la rétine postnatale. La perte combinée de BMP9 et BMP10 a entraîné une diminution de l'extension radiale vasculaire, l'élargissement des veines, et densification du réseau capillaire. Afin de distinguer la fonction cardiaque et hépatique de la BMP10, nous avons généré des modèles BMP10 KO en utilisant le promoteur inductible α-myosin heavy chain (αMHC)-MerCreMer ou le promoteur constitutif lecithin-retinol acyltransferase (Lrat)-Cre, exprimé dans les cellules stellaires hépatiques. Nous avons pu confirmer l'invalidation tissulaire spécifique de BMP10. De plus, l'analyse du plasma a révélé l'origine hépatique de l'hétérodimère BMP9/BMP10, dont le rôle reste à déterminer.

BMP9 and BMP10 are two specific ligands of the receptor ALK1, a type I BMP receptor mainly expressed on vascular endothelial cells. Mutations in the BMP9/BMP10/ALK1/ENG signalling pathway are linked to vascular diseases including hereditary hemorrhagic telangiectasia (HHT) and pulmonary arterial hypertension (PAH). BMP9 is expressed by the liver, whereas the primary source of BMP10 is the heart. However, BMP10 is also found to some extent in the liver, where it could form a BMP9/10 heterodimer, that has been described as circulating form responsible for ALK1 activity on endothelial cells. The aim of my thesis project was to unveil BMP9 and BMP10 functions in cardiovascular homeostasis in both postnatal and adult mouse models deficient for BMP9 and/or BMP10 and to discriminate between cardiac and hepatic BMP10 roles. While BMP9 was constitutively deleted, BMP10 deletion had to be achieved using the ubiquitous Rosa26 CreERT2 tamoxifen-inducible promoter, to bypass embryonic lethality.Our results show that BMP10 iKO adults did not develop any obvious age-dependent cardiovascular defects, however, concomitant deletion of the two ligands (double-KO Bmp9-/- R26CreERT2 Bmp10lox/lox) results in strong vascular defects, showing that both ligands participate to vascular homeostasis. In younger animals, we initially identified that tamoxifen-injected Rosa26 CreERT2 BMP10 iKO mice showed strong hematopoiesis defects. Unfortunately, we demonstrated that the observed phenotype was an artefact induced by CreERT2 toxicity. Indeed, upon tamoxifen administration to Rosa 26 CreERT2 pups lacking a targeted floxed allele, we observed a similar phenotype to that of the Rosa Cre BMP10 iKO. In the bone marrow of these animals, highly proliferative haematopoietic cells were strongly depleted, and the sinusoidal vessels were completely disorganised. Our work shed light on the importance of using the right controls when working with inducible Cre dependent mice models. Conversely, in the context of newborn lymphangiogenesis, we confirmed a functional role of BMP10 in the lymphatic vasculature which is not due to the Rosa 26 CreERT2.In addition, we proved the importance of BMP9 and BMP10 in vascular development and angiogenesis using the postnatal retina angiogenesis model. In particular, combined loss of BMP9 and BMP10 resulted in a significant decrease of the vascular radial extension, veins enlargement, arterial loss of αSMA coverage and a strong increase in capillaries density. In order to discriminate between cardiac and liver BMP10 function, we generated BMP10 KO models using either the cardiac-specific α-myosin heavy chain (αMHC)-MerCreMer inducible promoter or lecithin-retinol acyltransferase (Lrat)-Cre constitutive promoter, expressed in hepatic stellate cells. We could confirm tissue-specific BMP10 invalidation in both mice models. Moreover, analysis of the plasma obtained from these animals allowed us to confirm the hepatic origin of the circulating active heterodimer composed by BMP9 and BMP10, yet their functional role remains to be determined.