Etudes électrophysiologiques de (1) la régulation des canaux potassiques GIRK par les récepteurs δ-opioïdes et (2) la fonction des rhodopsines virales.

Electrophysiological studies of(1) the regulation of G protein-gatedpotassium channels by δ-opioid receptors and(2) the function of viral rhodopsins

• Auteur / Autrice : Ana Sofia Eria Oliveira
• Direction : Michel Vivaudou
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie structurale et nanobiologie
• Date : Soutenance le 21/04/2022
• Etablissement(s) : Université Grenoble Alpes
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale chimie et science du vivant (Grenoble ; 199.-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut de biologie structurale (Grenoble)
• Jury : Président / Présidente : Franck Fieschi
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Guillaume Sandoz
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Meritxell Canals, Félix Viana de la Iglesia

Mots clés

Mots clés contrôlés

Opiacés

Canaux potassiques

Optogénétique

Électrophysiologie

Mots clés libres

Electrophysiologie

Optogénétique

Canaux potassiques

Rhodopsines virales

Récepteurs aux opiacés

Electrophysiology

Optogenetics

Potassium channels

Viral rhodopsins

Opioid receptors

Résumé

Projet A - Double mécanisme de régulation des canaux potassiques GIRK par lesrécepteurs δ-opioïdes.La régulation des canaux potassiques GIRK (ou Kir3) par les récepteurs opioïdes (RO) modulela perception de la douleur. De manière caractéristique, les canaux GIRK sont activés par laliaison directe des sous-unités βγ de la protéine G libérées lors de l'activation de récepteurscouplés aux protéines G, tels que les RO.Dans ce projet, nous avons étudié la régulation des canaux GIRK par les RO en lescoexprimant dans des ovocytes de Xenopes et en mesurant l'activité des canaux à l'aide detechniques électrophysiologiques.Nos données révèlent une inhibition non encore décrite des canaux GIRK par les récepteursδ-opioïdes (DOR). Les agonistes opioïdes agissant par l'intermédiaire de DOR activent lescanaux GIRK à des concentrations nM mais les inhibent à des concentrations plus élevées.Notamment, l'inhibition des canaux GIRK a été révélée à des niveaux élevés d'expression deDOR. Des expériences de contrôle réalisées avec le récepteur μ-opioïde, étroitement lié, n'ontrévélé aucun signe d'inhibition, même à des niveaux d'expression comparables.Contrairement à l'activation du canal, l'inhibition ne semble pas nécessiter l'activation desprotéines G par le récepteur, ce qui suggère qu'il s'agit de deux voies de signalisationindépendantes. D'autres expériences suggèrent également que cette inhibition rapide ne peutpas être attribuée à des mécanismes déjà décrits impliquant des kinases de récepteurscouplés aux protéines G ou des arrestines.Ces observations mettent en évidence un niveau inattendu de complexité dans la régulationde GIRK par les RO, avec des implications mécanistiques et physiologiques qui restent àélucider complètement.Projet B - Étude de la fonction des rhodopsines viralesLes rhodopsines virales (RV) constituent un groupe monophylétique de protéines d'originevirale au sein de la superfamille des rhodopsines. Bien que plusieurs structures de RV aientviiiété résolues, leur fonction reste insaisissable. En tant que membres de la superfamille desrhodopsines, elles sont des protéines à 7-hélices transmembranaires liées de manièrecovalente à une molécule de rétinal capable de réagir à la lumière pour des fonctions tellesque le transport actif ou passif d'ions, ou des activités sensorielles de type kinases.Nous avons testé la fonction de plusieurs rhodopsines virales en les exprimant dans l'ovocytede Xenopes et en enregistrant les courants induits par la lumière. Pour évaluer l'expressionde surface des RV, nous avons développé une technique basée sur la nanoluciférase pourquantifier l'expression dans l'ovocyte.La caractérisation dans les ovocytes de Xenopes a montré que les RV s'accumulent au niveauintracellulaire plutôt qu'à la surface des cellules, et que leur activation par la lumière induit unelibération de calcium à partir des réserves intracellulaires. La libération de calcium induite parla lumière active ensuite les effecteurs de la signalisation calcique en aval, tels que les canauxchlorure activés par le calcium.Pour enregistrer directement l'activité des canaux des RV, nous avons pu rediriger un RV versla surface cellulaire en le fusionnant à un récepteur couplé à une protéine G à forte expression.La construction récepteur-RV a montré des courants photo-induits, mais la sélectivité reste àélucider.La libération précise du calcium à partir des réserves intracellulaires est le médiateur d'unelarge panoplie de processus cellulaires tels que l'expression génétique, la libération deneurotransmetteurs ou la contraction musculaire. La propension du RV à s'accumuler dansles membranes internes et à moduler la libération de calcium en fait un excellent candidatcomme nouvel outil optogénétique, avec des applications potentielles dans la manipulation denombreux aspects de l'activité cellulaire.

Project A - Dual mechanism of regulation of G protein-gated potassium channels by δ-opioid receptorsThe regulation of G protein-gated inwardly rectifying potassium channels (GIRK or Kir3channels) by Opioid receptors (OR) modulates pain perception. Characteristically, GIRKchannels are activated by the direct binding of the G protein βγ subunits released uponactivation of G protein-coupled receptors like OR.In this project, we have studied the regulation of GIRK channels by OR by coexpressing themand measuring channel activity using electrophysiological techniques.Our data disclose an unreported inhibition of GIRK channels by δ-opioid receptors (DOR).Opioid agonists acting through DOR activate GIRK channels at nM concentrations but inhibitthem at higher concentrations. Notably, inhibition of GIRK channels was revealed at high levelsof expression of DOR. Control experiments performed with the closely related μ-opioidreceptor did not show any sign of inhibition, even at comparable levels of expression.Unlike channel activation, inhibition appears not to require the receptor activation of G proteins,implying that these are two independent signaling pathways. Further experiments also suggestthat this fast inhibition cannot be attributed to already described mechanisms involving kinasesof G protein-coupled receptors or arrestins.These observations highlight another level of complexity in the regulation of GIRK by OR, withmechanistic and physiological implications that remain to be fully elucidated.Project B - Shedding light on the function of Viral RhodopsinsViral rhodopsins (VR) are a monophyletic group of proteins from viral origin within thesuperfamily of rhodopsins. While several VR structures have been solved, their functionremains elusive. As members of the rhodopsin superfamily, they are 7-transmembranespanning proteins covalently linked to a retinal molecule, which harvest light for potentiallyvidifferent functions such as ion pumping, ion channeling, sensory or kinase activities.We have tested the function of several viral rhodopsins by expressing them in oocytes andrecording the currents elicited upon their activation by light. To assess surface expression, wedeveloped a nanoluciferase-based technique to quantify protein expression in single oocytes.VR characterization in Xenopus oocytes showed that they accumulate intracellularly ratherthan at the cell surface, and that their activation by light induces calcium release fromintracellular stores. The light-induced calcium release subsequently activates downstreameffectors of calcium signaling, such as calcium-activated chloride channels.To record the channel activity of VRs directly, we were able to redirect one VR towards the cellsurface by fusing it to a high-expressing G protein-coupled receptor. The fusion constructdisplayed photo-induced currents, but selectivity remains to be fully elucidated.The precise release of calcium from intracellular stores mediates a large panoply of cellularprocesses such as gene expression, neurotransmitter release, or muscle contraction. Thepropensity of the VR to accumulate in internal storages and modulate calcium release makesit a great candidate as a novel optogenetic tool, with potential applications in the manipulationof many aspects of cell activity.