Caractérisation des monogalactosyldiacylglycérol synthases chez la diatomée modèle Phaeodactylum tricornutum

Characterisation of monogalactosyldiacylglycerol synthases in the model diatom Phaeodactylum tricornutum

• Auteur / Autrice : Nolwenn Gueguen
• Direction : Éric Maréchal
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie cellulaire
• Date : Soutenance le 13/05/2022
• Etablissement(s) : Université Grenoble Alpes
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale chimie et science du vivant (Grenoble ; 199.-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Laboratoire de physiologie cellulaire végétale (Grenoble)
• Jury : Président / Présidente : Corinne Mercier
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Éric Maréchal, Frédéric Domergue
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Yonghua Li-Beisson, Brigitte Gontero-Meunier

Mots clés

Mots clés contrôlés

Phylogénie

Lipides végétaux

Lipides des membranes

Microalgues

CRISPR-Cas9

Mots clés libres

CRISPR-Cas9

Monogalactosyldiacylglycérol

Glycérolipides

Diatomée

Phaeodactylum tricornutum

CRISPR-Cas9

Monogalactosyldiacylglycerol

Glycerolipids

Diatom

Phaeodactylum tricornutum

Résumé

Le monogalactosyldiacylglycérol (MGDG) est une classe de lipide rencontrée abondamment dans les membranes photosynthétiques. Le MGDG est connu pour jouer des rôles dans la biogénèse des thylakoïdes, et dans la stabilisation et la fonction des photosystèmes. Malgré son importance, peu d’informations sont disponibles sur la synthèse du MGDG dans des plastes complexes rencontrés dans certaines algues eucaryotes. En particulier, les diatomées contiennent un plaste secondaire entouré par quatre membranes dans lesquelles la composition précise en glycérolipides est encore inconnue. Dans cette thèse, nous nous sommes concentrés sur les trois isoformes de MGDG synthase (MGD) détectées par homologie de séquence chez la diatomée modèle Phaeodactylum tricornutum. L’analyse phylogénétique soutient que l’existence de trois types de MGD identifiés chez P. tricornutum semble être un trait conservé chez les diatomées. La localisation de fusions GFP par microscopie confocale a montré que chaque isoforme (numéroté α, β et γ) est localiseé dans un compartiment subcellulaire différent. MGDα est localisée à l’intérieur du plaste au voisinage des thylakoïdes. MGDβ se trouve dans le réseau vésiculaire périplastidial (aussi connu en tant que « blob ») et dans la membrane périplastidiale. MGDγ est une isoforme intriguante localisée dans le cytosol. Nous avons également détecté une séquence similaire à MGDγ dans des données génomiques d’un clade basal d’apicomplexe du phylum Grégarine, où le plaste vestigial habituel de ce groupe est absent. Ensemble, ces résultats indiquent que dans ces organismes complexes, une MGD a été relocalisée vers des compartiments extraplastidiaux de la cellule au cours de l’évolution. L’édition des gènes de MGDs cibles par CRISPR-Cas9 chez P. tricornutum a été réalisée avec succès. Plusieurs mutants « knock-out » ont été générés pour chaque isoforme. Bien que MGDα soit l’isoforme la plus exprimée dans la cellule, la suppression de l’expression de MGDα n’a pas conduit à de fortes altérations de la croissance cellulaire, de l’activité photosynthétique, ou de l’intégrité des membranes. De même, l’absence d’expression de MGDβ et MGDγ n’a conduit à aucun effet à l’échelle cellulaire. Un tel phénotype suggère que des mécanismes de compensation très efficaces existent en conditions optimales de culture. Chez la souche sauvage cultivée en carence d’azote, le niveau protéique de MGDα et MGDγ chute. La culture de mutants de MGDs a révélé que MGDβ et MGDγ pourraient jouer un rôle important sous de telles conditions de stress. Ce rôle spécifique devrait être étudié dans le futur. La variation des profils d’acides gras a été observée chez les différentes classes de glycérolipides membranaires. L’impact sur le MGDG suggère que chaque isoforme présente des préférences de substrat différentes, qui pourraient être liées à la disponibilité du substrat dans leur compartiment cellulaire respectif. La mutation de l’isoforme MGDγ a mené à de fortes altérations de la composition de plusieurs classes de lipides extraplastidiaux, comparée à celles des mutations des isoformes MGDα et MGDβ, suggérant un rôle critique dans l’homéostasies des lipides à l’échelle de la cellule entière. Des perspectives futures sur la synthèse, localisation et fonction du MGDG sont proposées.

Monogalactosyldiacylglycerol (MGDG) is a membrane lipid class found abundantly in photosynthetic membranes. MGDG is known to play roles in thylakoid biogenesis, and in stabilisation and function of the photosystem. Despite its importance, few information is available on MGDG synthesis in complex plastids found in some eukaryotic algae. In particular, diatoms contain a secondary plastid surrounded by four membranes in which the precise glycerolipid composition is still unknown. In this thesis, we focused on the three MGDG synthase (MGD) isoforms detected by sequence homology in the model diatom Phaeodactylum tricornutum.Phylogenetic analysis supports that the existence of the three types of MGD identified in P. tricornutum seems a conserved feature in diatoms. GFP-fusion localisation by confocal microscopy showed that each isoform (numbered α, β, and γ) localise to a distinct subcellular compartment. MGDα is located inside the plastid at the vicinity of thylakoids. MGDβ is in the periplastidial vesicular network (known also as the “blob”) and the periplastidial membrane. MGDγ is an intriguing cytosol-localised isoform. We also detected an MGDγ-like sequence in genomic data from basal apicomplexans of the Gregarina phylum, missing the usual vestigial plastid of this clade. Together, these results indicate that in these complex organisms, a MGD has been relocalised to extraplastidial compartments of the cell during evolution.The successful CRISPR-Cas9 edition of targeted MGD genes in P. tricornutum was achieved. Several knock-out mutants were generated for each isoform. Although MGDα is the most expressed isoform and localize at the vicinity of photosynthetic membranes, seeming therefore to act as the main isoform in the cell, MGDα knockout did not lead to any strong alteration in cell growth, photosynthetic activity and membrane integrity. Neither did MGDβ and MGDγ knockout lines. Such phenotype suggest that highly efficient compensation mechanisms exist under optimal growth conditions. In wild type cells cultivated in low nitrogen conditions, MGDα and MGDγ protein levels drop. Cultivation of the MGD mutant strains revealed that MGDβ and MGDγ may play an important role under such abiotic stress. Such specific role should be investigated in the future.Variation of the fatty acid profiles was observed in different classes of membrane glycerolipids. The impact on MGDG suggests that each isoform has distinct substrate preferences, which might be linked to substrate availability in their respective subcellular compartment. Mutation of the MGDγ isoform led to a strong alteration of the composition of several extraplastidial lipid classes, compared to MGDα and MGDβ isoforms, suggesting a critical role in lipid homeostasis at the whole cell level. Future prospects on MGDG synthesis, localisation and function are proposed.