Etude de l'organisation et de la dynamique de molécules impliquées dans la reconnaissance des cellules apoptotiques lors de l'efferocytose

Study of the organization and the dynamic of molecules involved in the recognition of apoptotic cells during efferocytosis

• Auteur / Autrice : Samy Dufour
• Direction : Philippe Frachet
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Virologie microbiologie immunologie
• Date : Soutenance le 18/02/2022
• Etablissement(s) : Université Grenoble Alpes
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale chimie et science du vivant (Grenoble ; 199.-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut de biologie structurale (Grenoble)
• Jury : Président / Présidente : Olivier Destaing
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Sandrine Fraboulet
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Pierre-Emmanuel Milhiet, Pascale Jeannin

Mots clés

Mots clés contrôlés

Microscopie à super-résolution

Phagocytose

Apoptose

Mots clés libres

Efferocytose

Cellule apoptotique

Cd47

Sr-F1

Microscopie à super-Résolution

Efferocytosis

Apoptotic cell

Cd47

Sr-F1

Super-Resolution microscopy

Résumé

L’élimination par phagocytose des cellules en apoptose (ou efferocytose) est un processus physiologique essentiel de l'immunité. C'est par ce mécanisme que chaque jour, les cellules qui meurent par apoptose sont éliminées par les phagocytes (ex : macrophage). Ce processus est crucial pour le développement, l'homéostasie tissulaire et la résolution de l'inflammation. En effet, l'élimination efficace des cellules apoptotiques est considérée comme un prérequis pour la prévention des maladies auto-immunes et inflammatoires. Une étape clé de l'efferocytose est la formation d'une zone de contact entre le phagocyte et la cellule apoptotique appelée efferosynapse. La réponse immune du phagocyte est coordonnée par les nombreuses molécules qui organisent et régulent cette interface. La cellule apoptotique expose à sa surface des « don’t eat-me » et « eat-me » signaux dont l’exposition évolue avec l’apoptose et qui sont reconnus par une grande variété de récepteurs exprimés par les phagocytes. Du fait de cette complexité, l’organisation moléculaire de l’efferosynapse, est encore méconnue. Néanmoins, sa caractérisation est cruciale pour déterminer quels sont les paramètres qui conditionnent la façon dont les signaux exposés par la cellule apoptotique vont être interprétés par le phagocyte. Une partie de mon travail visait à étudier l’organisation des « eat-me » signaux que sont la phosphatidylsérine (PS), la calréticuline (CRT), ainsi que la dynamique du « don’t eat-me » signal CD47, à la surface des cellules apoptotiques. Grâce à la microscopie de super résolution, nous avons mis en évidence la clustérisation de la CRT et son exclusion des domaines enrichis en PS au niveau des blebs apoptotiques. L’analyse de la dynamique de la protéine CD47 par suivi de molécule unique a révélé qu’elle est distribuée dans deux populations plus ou moins mobiles, et que la proportion de CD47 de plus forte mobilité augmente à la surface des cellules en apoptose. Enfin, bien que CD47 soit présent à la surface des blebs apoptotiques, il n’est plus reconnu par son récepteur SIRPα. Nos observations ont montré que ce résultat est indépendant de la mobilité de CD47, mais dépend de l’environnement membranaire et, en particulier, de l’intégrité des radeaux lipidiques qui sont déstabilisés durant l’apoptose. Par ailleurs, au niveau du phagocyte, une seconde partie de mon travail de thèse s’est focalisée sur un couple de protéines connues pour intervenir dans la reconnaissance et l’élimination des cellules apoptotiques chez la souris: le récepteur SR-F1 et la molécule du complément C1q. Nous nous sommes attachés à examiner le rôle potentiel de leur interaction dans un modèle de macrophage humain. Les analyses ont confirmé que le récepteur SR-F1 humain interagit avec la molécule C1q à la surface des macrophages. Néanmoins, elles ont également montré que sa surexpression à la surface des macrophages altère la phagocytose. Différentes pistes ont été explorées afin d’expliquer cet effet dans notre modèle, comme l’influence de l’expression du récepteur SR-F1 sur la différenciation des macrophages ou son implication dans l’adhérence cellulaire. Ensemble, ces données de microscopie à super résolution sur l’organisation et la dynamique des molécules impliquées dans la reconnaissance des cellules apoptotiques, constituent les premières briques vers la caractérisation de l’architecture de l’efferosynapse.

Efferocytosis is the process of apoptotic cell clearance by phagocytes (e.g macrophages) and is crucial during the development, tissue homeostasis and resolution of inflammation. Efficient removal of apoptotic cells by phagocytes is considered as a prerequisite for the prevention of autoimmune and inflammatory diseases. A key step of efferocytosis is the constitution of a phagocytic synapse also called efferosynapse between the apoptotic cell and the phagocyte. The immune response of the phagocyte is orchestrated by the numerous molecules that organize and regulate this interface. On the one hand, the apoptotic cell exposes on its surface "don't eat-me" and "eat-me" signals whose exposure evolves with apoptosis development and which are recognized, on the other hand, by a large variety of receptors expressed by phagocytes. Because of this complexity, the molecular organization of efferosynapse is still unknown. Nevertheless, its characterization is crucial to determine the parameters that condition the interpretation of apoptotic cell signals by the phagocyte. Part of my work aimed at studying the organization of the "eat-me" signals phosphatidylserine (PS), calreticulin (CRT), as well as the dynamics of the "don't eat-me" signal CD47, on the surface of apoptotic cells. Using super-resolution microscopy, we demonstrated the clustering of CRT and its exclusion from PS-enriched domains in apoptotic blebs. Analysis of CD47 dynamics by single molecule tracking revealed its distribution in two, more or less mobile populations and showed that the proportion of CD47 with higher mobility increases at the surface of the apoptotic cell. Finally, although CD47 is present on the surface of apoptotic blebs, it is no longer recognized by its receptor SIRPα. Our observations showed that this result is independent of the mobility of CD47, but depends on the membrane environment and in particular, on the integrity of the lipid rafts that are destabilized during apoptosis. Furthermore, the second part of my thesis work focused on a pair of proteins known to be involved at the phagocyte surface in the recognition and elimination of apoptotic cells in the mouse model: the SR-F1 receptor and the complement molecule C1q. We examined the potential role of their interaction in human cells models. The analyses confirmed that the human SR-F1 receptor interacts with the C1q molecule on the surface of human macrophages. However, they also showed that its overexpression on the surface of macrophages impairs phagocytosis. Different avenues were explored to explain this effect in our model, such as the influence of SR-F1 receptor over expression on macrophage differentiation or its involvement in cell adhesion. Together, these details of the organization and dynamics of the molecules involved in the recognition of apoptotic cells by super resolution microscopy, constitute the first building blocks towards the characterization of the architecture of the efferosynapse.