Étude du transcriptome circadien chez la souris à l'aide de séquençage long read Oxford Nanopore

Oxford Nanopore sequencing reveals a pervasive role for the mammalian circadian clock in shaping the tissue transcriptome

• Auteur / Autrice : Lies Chikhaoui
• Direction : Kiran Padmanabhan
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Sciences de la vie et de la santé
• Date : Soutenance le 21/10/2022
• Etablissement(s) : Lyon, École normale supérieure
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale de Biologie Moléculaire Intégrative et Cellulaire (Lyon ; 1999-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut de Génomique Fonctionnelle de Lyon (Lyon ; 2007-....)
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Kiran Padmanabhan, Ouria Dkhissi-Benyahya, Virginie Faure, Benjamin Audit, Sandrine Hughes, Joel David Richter, Marie Sémon, Yutaka Suzuki
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Ouria Dkhissi-Benyahya, Virginie Faure

Mots clés

Mots clés contrôlés

Protéomique

Rythmes circadiens

Épissage alternatif

Transcriptome

Mots clés libres

Transcriptome

Épissage alternatif

Rythmes circadiens

Séquençage Oxford Nanopore

Modifications post-transcriptionnelles

Protéomique

Transcriptome

Alternative splicing

Circadian rhythms

Oxford Nanopore sequencing

Post-transcriptionnal modifications

Proteomics

Résumé

Chez les mammifères, des horloges circadiennes robustes déterminent la rythmicité de nombreux phénomènes biologiques et coordonnent les programmes d'expression des gènes de manière spécifique aux tissus. Les analyses du transcriptome à l'aide de technologies conventionnelles, telles que les puces à ADN et Illumina-seq, ont révélé des rythmes dans environ 10 à 15% des gènes exprimés dans le foie. Le séquençage direct de l'ARN avec la technologie Oxford Nanopore permet la détection de différentes isoformes de gènes et donc l'étude des épissages/promoteurs alternatifs, la mesure précise de la longueur de la queue poly(A), ainsi que l'identification et la quantification des modifications épi-transcriptomiques, générant ainsi une vue complète du transcriptome. Nous avons réalisé un séquençage direct d’ARN avec un Promethion à un niveau sans précédent, générant plus de 100 millions de lectures directes d'ARN à partir de foies de souris de type sauvage sur 24 heures ainsi que de souris Per1-/-;Per2-/- dépourvues de rythmes circadiens. Les résultats de l'analyse révèlent de nouveaux transcrits cycliques, ainsi que des isoformes avec des dynamiques différentes(ou même en antiphase) générés à partir du même gène, suggérant une activité circadienne de l'épissage alternatif. De plus, nous avons identifié environ 2000 événements d'épissage alternatif dérégulés chez les souris PerKO et observé des changements d'isoformes qui pourraient avoir unimpact sur le métabolisme. Une analyse protéomique nous a permis d'identifier les acteurs potentiels de ce programme d'épissage altéré. De plus, nous avons trouvé une dynamique de la longueur de la queue polyA en fonction du temps ainsi qu'un changement global de la longueur de la queue polyA chez les souris PerKO.

In mammals, robust circadian clocks determine the rhythmicity of many biological phenomena and coordinate gene expression programs in a tissue-specific manner.Transcriptome analyses using conventional technologies, such as microarray and Illumina-seq, have revealed rhythms in approximately 10-15% of the genes expressed in the liver. Direct RNA sequencing with Oxford Nanopore technology allows the detection of different gene isoforms and thus the study of alternative splicing/promoters, the precise measurement of poly(A) tail length, and the identification and quantification of epi-transcriptomic modifications, thus generating acomprehensive view of the transcriptome.We performed long-read sequencing withPromethion at an unprecedented level, generating over 100 million direct RNA readsfrom livers of wild-type mice over 24 hours as well as from Per1-/-;Per2-/- micelacking circadian rhythms.Results of the analysis reveal new cyclic transcripts, aswell as isoforms with different dynamics (or even antiphase) generated from the same gene, suggesting a circadian activity of alternative splicing. Furthermore, we identified about 2000 deregulated alternative splicing events in PerKO mice andobserved isoform switches that could impact metabolism. A Proteomics analysis allowed us to identify potential players in this altered splicing program. In addition, we found time-dependent polyA tail length dynamics as well as a global change in taillength in PerKO mice.