Étude par analyses protéomiques du rôle de SUMO et de FMRP dans la régulation de la diversité protéique de la synapse

Study by proteomic analysis of the role of SUMO and FMRP in the proteome diversity regulation at the synapses

• Auteur / Autrice : Félicie Kieffer
• Direction : Carole Gwizdek
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Interactions Moléculaires et Cellulaires
• Date : Soutenance le 13/10/2022
• Etablissement(s) : Université Côte d'Azur
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Sciences de la vie et de la santé (Sophia Antipolis, Alpes-Maritimes)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut de pharmacologie moléculaire et cellulaire (Sophia Antipolis, Alpes-Maritimes)
• Partenaire(s) de recherche : établissement de préparation : Université Côte d’Azur (2020-....)
• Jury : Président / Présidente : Barbara Bardoni
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Barbara Bardoni, Florence Rage, Izabela Sumara
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Florence Rage, Izabela Sumara

Mots clés

Mots clés contrôlés

Synapses

Sumoylation

Protéines de liaison à l'ARN

Troubles du spectre de l'autisme

Syndrome de l'X fragile

Mots clés libres

Syndrome de l'X fragile

Troubles du spectre de l'autisme

Métabolisme des ARMm

Protéine de liaison à l'ARN

Dialogue noyau-Synapse

SUMOylation

Fragile X syndrome

Asd

MRNA metabolism

RNA binding protein

Nucleus-Synapse dialogue

SUMOylation

Résumé

Les synapses sont des structures hautement spécialisées qui interconnectent les neurones pour former des réseaux fonctionnels dédiés à la communication neuronale. Les synapses subissent de nombreux réarrangements avec notamment des modifications constantes de leur composition protéique. Afin de créer de la diversité protéique, plusieurs processus entrent en jeu, de la transcription à la traduction locale. En effet, à partir d'un même gène, plusieurs protéines peuvent être synthétisées sous l'action de différentes étapes de maturation des ARNm. Par ailleurs, les protéines peuvent également, une fois synthétisées, subir des modifications post-traductionnelles comme la méthylation, l'ubiquitination ou bien encore la SUMOylation, qui peuvent modifier leur stabilité, leur localisation ou bien encore leur capacité d'interactions. Ainsi, de nombreux processus participent à la diversité protéique, faisant eux-mêmes intervenir de nombreux acteurs. Au cours de ma thèse, j'ai étudié le rôle de deux acteurs de la diversité protéique de la synapse : SUMO et FMRP. Ces études ont permis, par le biais d'analyses de protéomique, d'acquérir une vision plus large de l'importance de ces facteurs dans la physiologie neuronale.La SUMOylation est une modification post-traductionelle qui consiste en la liaison covalente mais réversible du peptide SUMO (Small Ubiquitin-like-Modifier) sur une protéine cible. Bien que majoritairement présent dans le noyau, SUMO est également un régulateur important des fonctions synaptiques. Pour obtenir une vision globale des protéines synaptiques endogènes modifiées par SUMO, nous avons combiné un fractionnement subcellulaire de cerveaux de rat avec une immunoprécipitation couplée à de la spectrométrie de masse. Notre crible a identifié 803 protéines candidates de la SUMOylation, ce qui représente environ 18 % du protéome synaptique. Notre liste, qui constitue le premier SUMOylome synaptique, comprend des récepteurs de neurotransmetteurs, des transporteurs, des molécules d'adhésion, des protéines d'échafaudage ainsi que du trafic vésiculaire et des protéines associées au cytosquelette, définissant SUMO comme un régulateur central de l'organisation et de la fonction synaptique. De plus, de nombreuses protéines identifiées dans notre crible sont directement impliquées dans des troubles neurologiques, suggérant une participation de la SUMOylation dans l'étiologie de maladies cérébrales. L'identification et la caractérisation de ces protéines SUMOylées permettent de mettre en lumière que la SUMOylation participe à la complexité protéique à la synapse, régulant ainsi de nombreuses fonctions neuronales.Un autre acteur important pour la diversité protéique à la synapse est la protéine FMRP. C'est une protéine de liaison à l'ARN qui est absente chez les patients atteints du Syndrome de l'X-Fragile (SXF). Ce trouble du neurodéveloppement est la cause majeure de déficience intellectuelle héréditaire et la première cause monogénique de troubles du spectre de l'autisme (TSA). FMRP est une protéine majoritairement cytoplasmique connue pour contrôler la traduction locale d'ARNm à la synapse. De façon intéressante, FMRP présente des signaux d'import et d'export nucléaires. Cependant, les fonctions de la protéine dans le noyau restent peu documentées à ce jour, en particulier dans les neurones de mammifères. Par des expériences de co-purification couplées à une analyse par spectrométrie de masse, nous avons caractérisé l'interactome nucléaire de FMRP. Celui-ci comprend notamment plusieurs protéines impliquées dans la transcription, l'épissage ou l'export nucléaire des ARNm. Nos travaux suggèrent donc modèle original selon lequel FMRP serait un régulateur de la diversité protéique en contrôlant non seulement la traduction locale à la synapse mais également en participant à la diversité du répertoire des transcrits en modulant par exemple leur épissage ou bien encore leur édition.

Synapses are highly specialized structures that interconnect neurons to form functional networks dedicated to neuronal communication. Synapses undergo numerous rearrangements including constant changes in their protein composition. In order to create protein diversity, several processes come into play, from transcription to translation local to the synapses. Indeed, from the same gene, several proteins can be synthesized under the action of different stages of mRNA maturation. Moreover, once synthesized, proteins can also undergo post-translational modifications such as methylation, ubiquitination or SUMOylation, which can modify their stability, their localization or their ability to interact. Thus, many processes are involved in protein diversity, themselves involving many actors. During my thesis, I studied the role of two actors in the regulation of protein diversity at the synapse: SUMO and FMRP. These studies allowed me to gain a broad view of the importance of SUMO and FMRP in neuronal physiology through proteomic analyses.SUMOylation is a post-translational modification that consists in the covalent but reversible attachment of the SUMO (Small Ubiquitin-like-Modifier) peptide to a target protein. Although mostly present in the nucleus, SUMO is also an important regulator of synaptic functions. To obtain a comprehensive view of endogenous SUMO-modified synaptic proteins, we combined subcellular fractionation of rat brains with immunoprecipitation coupled to mass spectrometry analysis. Our screen identified 803 SUMOylated candidate proteins, which represents approximately 18% of the synaptic proteome. Our dataset includes neurotransmitter receptors, transporters, adhesion molecules, scaffolding proteins as well as vesicular trafficking and cytoskeleton-associated proteins, defining SUMO as a central regulator of synaptic organization and function. Furthermore, many of the proteins identified in our screen are directly involved in neurological disorders, suggesting a participation of SUMOylation in the etiology of brain diseases. The identification and characterization of these SUMOylated proteins highlight that SUMOylation participates in protein complexity at the synapse, regulating many neuronal functions.Another important player in synaptic protein diversity is the FMRP protein. It is an RNA-binding protein that is absent in patients with Fragile-X Syndrome (FXS). This neurodevelopmental disorder is the major cause of hereditary intellectual disability and the first monogenic cause of autism spectrum disorders (ASD). FMRP is a predominantly cytoplasmic protein known to control local mRNA translation at the synapse. Interestingly, FMRP has both nuclear import and export signals. However, the functions of the protein in the nucleus remain poorly documented to date, particularly in mammalian neurons. By co-purification experiments coupled to mass spectrometry analysis, we have characterized the nuclear interactome of FMRP. This includes several proteins involved in transcription, splicing or nuclear export of mRNAs. Our work suggests that FMRP is a regulator of protein diversity by controlling not only local translation at the synapse but also by participating in the diversity of the transcripts repertoire modulating for example, splicing or editing.