Modélisation des mutations induites par les rétrotransposons dans les cellules humaines par l'édition du génome

Modelling retrotransposon-induced mutations in human cells through genome engineering

• Auteur / Autrice : Vivien Weber
• Direction : Gaël Cristofari
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Interactions Moléculaires et Cellulaires
• Date : Soutenance le 25/03/2022
• Etablissement(s) : Université Côte d'Azur
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Sciences de la vie et de la santé (Nice ; 1992-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut de recherche sur le cancer et le vieillissement (Nice)
• Partenaire(s) de recherche : établissement de préparation : Université Côte d’Azur (2020-....)
• Jury : Président / Présidente : Véronique Paquis-Flucklinger
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Véronique Paquis-Flucklinger, Julia Fuchs Sèbe, Salvatore Spicuglia
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Julia Fuchs Sèbe, Salvatore Spicuglia

Mots clés

Mots clés contrôlés

Rétrotransposons

CRISPR-Cas9

Génome humain

Mots clés libres

Rétrotransposon

Édition génomique

Line-1

CRISPR/Cas9

Humain

Retrotransposon

Genome engineering

Line-1

CRISPR/Cas9

Human

Résumé

Les éléments transposables représentent environ la moitié de notre génome. La seule famille active de manière autonome chez l'Homme est composée des rétrotransposons de type long interspersed element-1 (LINE-1 ou L1). Ces éléments génétiques mobiles se répliquent par un mécanisme de copier-coller, appelé rétrotransposition. La machinerie de rétrotransposition du L1 peut également mobiliser en trans des rétrotransposons non codants, tels que les séquences Alu ou SVA. Par conséquent, l'activité des L1s provoque, directement ou indirectement, des variations structurales du génome, et entraîne parfois des maladies génétiques dans la lignée germinale ou un mosaïcisme somatique dans de nombreux types de cancer. Les rétrotransposons s'insèrent fréquemment dans les introns, ce qui peut influencer l'expression des gènes associés à travers divers mécanismes, tels que l'initiation alternative de la transcription, le saut d'exon, l’exonisation de fragments de L1 ou de séquences adjacentes, les défauts d'élongation de la transcription, la polyadénylation prématurée, voire la transcription antisens. Cependant, pour la plupart des insertions introniques, on ne sait pas si elles ont une influence sur l'expression des gènes et - si oui - par quel mécanisme.Pour étudier les mécanismes moléculaires par lesquels les insertions introniques de L1 ont un impact sur l'expression des gènes, nous avons créé des modèles de cellules en culture comprenant une insertion L1 pathogène historique trouvée dans le gène RP2 et causant la rétinite pigmentaire, une maladie liée à l'X et caractérisée par une perte progressive de la vision. Pour ce faire, nous avons procédé à l'ingénierie génomique, par l'intermédiaire de Cas9, de cellules épithéliales rétiniennes immortalisées provenant d'un donneur masculin. Comme décrit initialement dans les échantillons de patients, la présence de l'élément L1, dans la même orientation que le gène RP2, réduit fortement l'expression de RP2, en accord avec une perte de fonction du gène. En revanche, l'insertion d'une séquence L1 en antisens, ou d’une séquence non apparentée, a peu d'impact sur l'expression de RP2. Dans l'ensemble, ces observations indiquent que la pathogénicité de L1 n'est pas causée par la perte d'un élément agissant en cis sur le site ciblé, mais plutôt par la transplantation ectopique de nouvelles séquences agissant en cis. Les effets différentiels des insertions L1 sens et antisens suggèrent également que ces signaux peuvent agir au niveau de l'ARN. Cette approche ciblée ouvre la voie à la dissection des mécanismes moléculaires conduisant à la pathogenèse médiée par les L1s.En parallèle, nous avons commencé à développer un essai fonctionnel à haut débit pour tester de façon systématique l'influence des insertions de rétrotransposons dans les gènes. Dans cette approche non biaisée, des séquences Alu sont insérées de manière aléatoire in vitro dans une banque de plasmides contenant des gènes de petite taille avec leurs exons et leurs introns sous le contrôle d'un promoteur constitutif fort. Ensuite, le séquençage nanopore en longues lectures de la banque de plasmides permet de faire correspondre les identificateurs moléculaires uniques (UMI) ajoutés dans la région 3' non traduite du gène avec la position de la séquence Alu insérée au hasard. Enfin, la banque de plasmides est transfectée dans des cellules en culture et les niveaux d'UMI sont mesurés par RNA-seq en lecture courte, ce qui reflète le niveau d'expression de chaque variant transcrit. Les premiers développements de cette méthode sont présentés et discutés.En résumé, nous avons conçu des stratégies complémentaires pour étudier les effets des insertions de rétrotransposons introniques sur l'expression des gènes. Sur le long terme, notre travail pourrait aider à discriminer les polymorphismes d'insertion de rétrotransposons trouvés chez les patients ou dans la population humaine, avec un impact potentiel sur la santé et les maladies.

Transposable elements (TEs) account for approximately half of our genome. The only autonomously active family in humans is composed by the long interspersed element-1 (LINE-1 or L1) retrotransposons. These mobile genetic elements can replicate through a copy-and-paste mechanism, a process known as retrotransposition. The L1 retrotransposition machinery can also mobilize (in trans) non-coding retrotransposons, such as the Alu or SVA sequences. Consequently, L1 activity directly or indirectly causes genomic structural variation, occasionally leading to genetic diseases in the germline or to somatic mosaicism in a variety of cancer types. Retrotransposons frequently insert into introns, which can influence the expression of the surrounding genes in various ways. Demonstrated or hypothetical mechanisms include alternative transcription initiation, exon skipping, exonization of L1 fragments or adjacent sequences, transcription elongation defects or premature polyadenylation, or even antisense transcription. However, for most intronic insertions, it remains unknown whether they have any influence on gene expression and - if so - by which mechanism.To study the molecular mechanisms by which intronic L1 insertions impact gene expression, we created cultured cell models of a historical pathogenic L1 insertion found in the RP2 gene and causing retinitis pigmentosa, an X-linked disease characterized by gradual vision loss. This was achieved by Cas9-mediated genome engineering of immortalized retinal epithelium cells derived from a male donor. As originally described in patient samples, the presence of the L1 element, in the same orientation as the RP2 gene, strongly reduces RP2 expression, consistent with RP2 loss-of-function. In contrast, insertion of an antisense L1 or unrelated sequence has little impact on RP2 expression. Altogether these observations indicate that L1 pathogenicity is not caused by the loss of a cis-acting element at the target site, but rather by the ectopic transplantation of new cis-acting sequences. The differential effects of sense and antisense L1 insertions further suggests that these signals may act at the RNA level. This targeted approach paves the way to dissect the molecular mechanisms leading to L1-mediated pathogenesis.In parallel, we started to develop a high-throughput functional assay to systematically test the influence of retrotransposon insertions into genes. In this unbiased approach, Alu sequences are randomly inserted in vitro into a plasmid library containing short genes with their exons and introns under the control of a strong constitutive promoter. Then, long-read nanopore sequencing of the plasmid library allows to match unique molecular identifiers (UMI) added in the genic 3’ untranslated region with the position of the randomly inserted Alu sequence. Finally, the plasmid library is transfected into cultured cells and UMI levels are measured by short-read RNA-seq, reflecting the expression level of each transcript variant. Initial developments of this method are presented and discussed.Altogether we designed complementary strategies to study the effects of intronic retrotransposon insertions on gene expression. In the long term, our work could help discriminate retrotransposon insertion polymorphisms found in patients or in the human population with a potential impact on health and disease.