Analyse de l'ubiquitination induite par UBE3A et de son rôle dans la régulation de l'excitabilité du cortex préfrontal

Analysis of UBE3A induced ubiquitination and its role in regulating prefrontal cortex excitability

• Auteur / Autrice : Unai Alduntzin Egizurain
• Direction : Andreas Frick, Ugo Mayor
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Neurosciences
• Date : Soutenance le 16/12/2022
• Etablissement(s) : Bordeaux en cotutelle avec Universidad del País Vasco
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Sciences de la vie et de la santé (Talence, Gironde ; 1993-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Neurocentre Magendie (Bordeaux) - Neurocentre Magendie (Bordeaux)
• Jury : Président / Présidente : Jose Luis Rosa
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Jose Luis Rosa, Catherine Lindon, Olga Peñagarikano, Christophe Mulle, Amanda Sierra, Manuel Rodriguez
• Jury : Rapporteur / Rapporteuse : Jose Luis Rosa, Catherine Lindon

Mots clés

Mots clés contrôlés

Protéine LGI1

Cortex préfrontal

Ubiquitinylation

Angelman, Syndrome d'

Mots clés libres

Ube3a

Syndrome d'Angelman

Ubiquitination

Excitabilité préfrontale

Ube3a

Angelman Syndrome

Ubiquitination

Prefrontal excitability

Résumé

L'absence d'ubiquitine E3 ligase UBE3A fonctionnelle dans le cerveau entraîne un trouble neurodéveloppemental rare, le syndrome d'Angelman (SA), associé à des altérations de la fonction du cortex préfrontal (CPF) et à des troubles cognitifs. La surexpression d'UBE3A, en revanche, entraîne un syndrome Dup15q lié à un trouble du spectre autistique. Bien que la base génétique du syndrome d'Angelman et la physiopathologie observée chez l'homme et dans des modèles animaux de ce syndrome aient été largement décrites, les mécanismes moléculaires régulés par l'ubiquitination médiée par UBE3A dans le cerveau restent insaisissables. Il est donc impératif non seulement d'identifier les substrats neuronaux d'UBE3A et d'autres protéines impliquées dans la voie ubiquitine-protéasome, mais aussi de comprendre la fonction neurologique de ces protéines.Dans ce travail, nous avons identifié plusieurs substrats neuronaux d'ubiquitination d'UBE3A. Pour ce faire, nous avons analysé les données protéomiques d'échantillons de cerveau d'une souris surexprimant UBE3A croisée avec une souris bioUb, un outil de découverte in vivo permettant d'isoler, d'identifier et de quantifier par spectrométrie de masse les protéines ubiquitinées de manière endogène. Nous avons constaté que l'ubiquitination d'UBE3A cible principalement les protéines synaptiques, ce qui expliquerait les altérations comportementales, cognitives et fonctionnelles observées dans le syndrome d'Angleman. Nous avons également validé, à l'aide d'un test pull-down GFP, les substrats candidats d'UBE3A DDI1 et DDI2, précédemment identifiés chez Drosophila melanogaster et dans des cellules humaines.Nous avons également montré que le substrat DDI2 d'UBE3A pourrait jouer un rôle dans la régulation de l'excitabilité du cortex préfrontal. En développant un modèle de knockdown de DDI2 médié par shRNA et en effectuant des enregistrements in vitro de neurones pyramidaux de la couche V du cortex prélimbique dans le CPF, nous avons pu découvrir des altérations de plusieurs paramètres de l'excitabilité neuronale, y compris un seuil de potentiel d'action plus bas et une augmentation du taux maximal de changement du potentiel d'action. Il reste à élucider comment cette protéine protéasomique pourrait induire ces changements et si ces changements sont liés au syndrome d'Angelman.L'ubiquitination des protéines n'est pas seulement modulée par les ligases E3, mais aussi par les enzymes de déubiquitination (DUBs). L'identification et la caractérisation des DUB responsables de la neutralisation d'UBE3A pourraient conduire à des cibles thérapeutiques susceptibles d'améliorer les symptômes du SA. Une étude précédente de notre laboratoire a démontré que USP9X, une DUB associée à la déficience intellectuelle liée à l'X, contrecarre l'ubiquitination médiée par UBE3A. Dans cette thèse, nous avons réalisé des enregistrements in vitro par patch clamp dans des tranches corticales de souris C57BL/6 en nous concentrant sur les cellules pyramidales de la couche V du cortex prélimbique, l'un des principaux types de neurones de sortie du CPF, et nous avons mesuré plusieurs paramètres d'excitabilité neuronale tout en inhibant l'activité de USP9X avec deux inhibiteurs spécifiques, WP1130 et FT709. Nous avons constaté que le blocage de USP9X avec WP1130 conduit à des changements dans plusieurs paramètres de l'excitabilité neuronale, les plus importants étant une augmentation du rapport sag et du milieu après hyperpolarisation. Nos résultats suggèrent que l'UPS9X régule l'activité ou l'expression de différents canaux ioniques qui contribuent aux propriétés intrinsèques régulant les propriétés membranaires de base et l'intégration synaptique.

The lack of functional ubiquitin E3 ligase UBE3A in the brain leads to the rare neurodevelopmental disorder Angelman Syndrome (AS), associated with alterations in prefrontal cortex (PFC) function and cognitive impairment. Overexpression of UBE3A on the other hand leads to Dup15q syndrome linked with autism spectrum disorder. While the genetic basis of AS and the pathophysiology observed both in humans and in animal models of AS has been extensively described, the molecular mechanisms regulated by UBE3A mediated ubiquitination in the brain remain elusive. It is imperative then to not only identify neuronal substrates of UBE3A and other proteins involved in the ubiquitin-proteasome pathway but to understand the neurological function of those proteins.In this work we have identified several neuronal ubiquitination substrates of UBE3A. This was achieved by analysing proteomic data from brain samples of a UBE3A overexpressing mouse crossed with a bioUb mouse, a in vivo discovery tool for the isolation, identification and quantification by mass spectrometry of proteins ubiquitinated endogenously. We have found that UBE3A ubiquitination mainly targets synaptic proteins, that would explain the behavioral, cognitive and functional alterations observed in Angleman Syndrome. We have also validated, using a GFP pull-down assay, UBE3A candidate substrates DDI1 and DDI2, previously identified in Drosophila melanogaster and human cells.We have also shown that UBE3A substrate DDI2 might play a role regulating prefrontal cortex excitability. By developing an shRNA mediated DDI2 knockdown model and by performing in vitro whole cell recordings from layer V pyramidal neurons of the Prelimbic cortex in the PFC, we were able to discover alterations of several parameters of neuronal excitability, including lower action potential threshold and increased maximal rate of change of action potential. How this proteasomal protein could induce those changes and whether the changes are linked with Angelman Syndrome remains to be elucidated.Protein ubiquitination is not only modulated by E3 ligases, but also by deubiquitinating (DUB) enzymes. Identifying and characterizing DUBs responsible of counteracting UBE3A could lead to therapeutic targets that could ameliorate AS symptoms. A previous study from our lab demonstrated that USP9X, a DUB associated with X-linked intellectual disability, counteracts UBE3A mediated ubiquitination. In this thesis we have performed in vitro patch clamp recordings in cortical slices of C57BL/6 mice focusing on pyramidal cells of layer V in the Prelimbic cortex, one of the main output neuron types of the PFC, and measured several parameters of neuronal excitability while inhibiting USP9X activity with two specific inhibitors, WP1130 and FT709. We have found that blocking USP9X with WP1130 leads to changes in several parameters of neuronal excitability, the most prominent being an increase in the sag ratio and in the medium after hyperpolarization (mAHP). Our results suggest that UPS9X regulates the activity or expression of different ion channels that contribute to intrinsic properties regulating basic membrane properties and synaptic integration.