Druggabilité des protéines spécifiques aux kinétoplastides liées à la traduction des ARNm : Etude par cryo-Microscopie Électronique

Druggability of kinetoplastid-specific mRNA translation-related proteins : Structural investigation by cryo-Electron Microscopy

• Auteur / Autrice : Mayara Lúcia Del cistia
• Direction : Yaser Hashem
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Interface Chimie Biologie
• Date : Soutenance le 14/12/2022
• Etablissement(s) : Bordeaux
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Sciences de la vie et de la santé (Talence, Gironde ; 1993-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Acides Nucléiques : Régulations Naturelle et Artificielle (2016-....)
• Jury : Président / Présidente : Mélanie Bonhivers
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Mélanie Bonhivers, Reynald Gillet, Barbara Papadopoulou, Frédéric Bringaud
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Reynald Gillet, Barbara Papadopoulou

Mots clés

Mots clés contrôlés

Trypanosomiase américaine

Cryomicroscopie

Études cliniques

Kinetoplastida

Mots clés libres

Initiation de la traduction

Kinétoplastides

Cibles médicamenteuses

Cryo-ME

Translation initiation

Kinetoplastids

Drug targets

Cryo-EM

Résumé

Les kinétoplastides sont un groupe d'eucaryotes unicellulaires flagellés, qui comprend des espèces infectieuses pour les mammifères telles que Trypanosoma cruzi, Trypanosoma brucei et Leishmania spp. Ils sont respectivement les parasites responsables des maladies de Chagas et de sommeil, et des les Leishmanioses. Les traitements actuels contre ces parasites sont basés sur des médicaments non spécifiques avec des effets secondaires agressifs, en plus des problèmes de résistance aux médicaments croissante. Le ribosome est une cible de choix pour un large éventail de molécules thérapeutiques (antibiotique). Le ribosome d’eucaryotes (appelé aussi le 80S) est composé d'une petite sous-unité (40S) et d'une grande sous-unité (60S). La traduction des ARNm est effectuée par le ribosome et est divisée en 4 étapes : l’initiation, l’élongation, la terminaison et le recyclage. L'initiation est une des étapes clé de la régulation du niveau de traduction des ARNm. Elle met en jeu une douzaine de facteurs initiateurs connus et passe par l'assemblage et le désassemblage de nombreux complexes intermédiaires. Comparé à celui des mammifères, le ribosome des kinétoplastides présente de nombreuses différences structurelles qui suggèrent des variations dans leur processus de traduction des ARNm. Parmi lesquels il y a une bona fide protéine ribosomique spécifique aux kinétoplastides qui a été découverte dans notre équipe et appelée ‘KSRP’ (« kinetoplastids-specific ribosomal protein »). KSRP interagit fortement avec le 40S via des régions spécifiques aux kinétoplastides, notamment les segments d'expansion d'ARNr (ES 3S et 6S) et la protéine ribosomique eS6 via sa queue C-terminale. Cependant, le rôle exact de KSRP reste inconnu. La spécificité et l'essentialité de KSRP (sa délétion est létale pour les parasites) en font une cible thérapeutique potentielle.Une autre protéine spécifique aux kinétoplastides impliquée dans la traduction a été devant rapportée par notre équipe. En effet, notre équipe a déterminé la structure du CPI (complexe de pré-initiation) 43S de T. cruzi par cryo-ME à une résolution de 3,33Å. L'analyse a révélé la présence de nombreux aspects spécifiques aux kinétoplastides, y compris la présence de une hélicase que nous avons appelée k-DDX60. k-DDX60 interagit avec le CPI formé sur le 40S au niveau de l’interface entre les sous-unité, et entraîne une stabilisation accrue du CPI et l'obstruction du canal d’interaction de l'ARNm dans le 40S. Bien que la fonction de k-DDX60 ne soit pas encore claire, son expression est essentielle pour ces organismes. En plus, il a été possible de démontrer que le CPI présente des différences structurelles importants par rapport à les mammifères, notamment au niveau de facteur d'initiation eucaryote eIF3 et de ses interactions avec les segments d’expansion 9S, 7S et 6S de l’ARNr.Au cours de ce travail, j'ai étudié ces deux protéines. 1- D’une part, j'ai établi un protocole efficace et reproductible pour la purification du CPI de L. tarentolae en conditions natives, ce qui a permis d'obtenir une structure de haute résolution de ce complexe apportant des données supplémentaires sur les interactions de k-DDX60 ainsi que son possible rôle. 2- D’autre part, j'ai créé des lignées de L. tarentolae avec des mutations ponctuelles sur KSRP (his-tagged) ainsi qu'un protocole de purification fiable basé sur un gradient de saccharose et une chromatographie d'affinité, ce qui m'a permis de purifier le ribosome portant différents mutants de KSRP dont les structures ont été résolues par cryo-ME. Il a permis l'identification de résidus cruciaux pour la liaison de KSRP sur 40S et en particulier, une poche d’interaction essentielle constituée de 3 résidus aromatiques.Ces découvertes ont remarquablement amélioré nos connaissances de la régulation du processus de traduction des ARNm chez ces parasites et ont le potentiel d'être exploitées pour le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques

Kinetoplastids are a group of flagellated unicellular eukaryotes, which includes species infectious to mammals such as Trypanosoma cruzi, Trypanosoma brucei and Leishmania spp, the causative agents of Chagas disease, Sleeping sickness and Leishmaniasis, respectively. Current treatments against these parasites are based on non-specific drugs with aggressive side effects in addition to increasing drug resistance issues. The ribosome is a choice target for a wide range of therapeutic molecules (antibiotic). The ribosome (often referred to as the 80S) is composed of a small (SSU or 40S) and a large (LSU or 60S) subunits. mRNA translation is carried out by the ribosome and it is divided into 4 major steps: initiation, elongation, termination and recycling. Translation initiation is one of the most regulated steps counting a dozen known initiation factors and encompassing the assembly and disassembly of numerous intermediate complexes. When compared to mammals, the kinetoplastids ribosome presents numerous structural differences that suggest a level of variability in the regulation of their mRNA translation process.Among these structural differences figures a bona fide kinetoplastid-specific ribosomal protein discovered in our team, which was termed “KSRP”. KSRP interacts strongly with the 40S via kinetoplastids-specific regions; rRNA expansion segments (ES3S and ES6S) and the ribosomal protein eS6 through its C-terminal tail. However, the exact role of KSRP remains unknown. The species specificity and the essentiality of KSRP (its deletion is lethal for kinetoplastids) point it out as a potential therapeutic target.Another kinetoplastid-specific translation-related protein was discovered by our team and corresponds to a helicase (that we have termed k-DDX60). Indeed, our team has determined the structure of the PIC (pre-initiation complex) 43S from T. cruzi by cryo-EM at a resolution of 3.33Å. It revealed the presence of numerous kinetoplastid-specific aspects including the presence of the species-specific k-DDX60 helicase. It interacts with the PIC at the intersubunit face, which results in the increased stabilization of the PIC and the obstruction of the 40S mRNA binding channel. Although its function is still unclear, k-DDX60 expression is essential for these organisms. In addition to k-DDX60, it was possible to demonstrate that the PIC presents significant structural differences compared to its counterpart in mammals, in particular at the level of eIF3 (eukaryotic initiation factor 3) and its interactions with the rRNA ESs 9S, 7S and 6S.During my thesis I have studied these two proteins and 1- first established an efficient and reproducible protocol for the purification of the PIC from Leishmania tarentolae under native conditions, which allowed to obtain a high-resolution structure of this complex providing additional data on the interaction sites of k-DDX60 and hinted on its possible role. 2- Secondly, I created lines of L. tarentolae with point mutations of KSRP (his-tagged) along with a reliable purification protocol based on a sucrose gradient and affinity chromatography, which allowed me to purify the ribosome harbouring different mutants of KSRP whose structures were solved by cryo-EM. This strategy allowed the identification of crucial residues for the binding of KSRP on 40S and in particular an essential binding pocket consisting of 3 aromatic residues.These discoveries have substantially advanced our knowledge in mRNA translation regulation pathways in these parasites and have the potential to be exploited for rational drug design