Elucider la redondance fonctionnelle des complexes d'élongation des acides gras à très longue chaine chez Arabidopsis

Elucidating the functional redundancy of the Fatty Acid Elongase complexes in Arabidopsis

• Auteur / Autrice : Marguerite Batsale
• Direction : Jérôme Joubès
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie végétale
• Date : Soutenance le 12/12/2022
• Etablissement(s) : Bordeaux
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Sciences de la vie et de la santé (Talence, Gironde ; 1993-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Laboratoire de biogénèse membranaire, UMR 5200 (Villenave-d'Ornon, Gironde)
• Jury : Président / Présidente : Laure Béven
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Florence Bordes
• Jury : Rapporteur / Rapporteuse : Rochus Benni Franke, Sébastien Baud

Mots clés

Mots clés contrôlés

Enzymes végétales

Levures (botanique)

Acides gras

Arabidopsis

Mots clés libres

Arabidopsis

Acides gras à très longue chaîne

Elongases

Levure

Arabidopsis

Very Long Chain Fatty Acids

Enlongases

Yeast

Résumé

Les Acides Gras à Très Longues Chaines (AGTLC) représentent des molécules très importantes chez les plantes du point de vue physiologique mais également structural. Avec une chaîne composée de 20 atomes de carbone ou plus, les AGTLC constituent une grande diversité de molécules utilisées pour la synthèse de nombreux lipides dont les phospholipides et sphingolipides présents dans les membranes, les cires cuticulaires en surface de l’épiderme, les subérines au niveau des racines ou encore les triacylglycérols (TAG) dans les graines. Les AGTLC sont donc impliqués dans différents mécanismes tels que le trafic membranaire, la division et différentiation cellulaire, le contrôle de la perte en eau ou encore le stockage de l’énergie, le tout permettant aux plantes de grandir et de s’adapter aux contraintes environnementales variables.L’élongation des AGTLC est réalisée au niveau du complexe FAE (pour Fatty Acid Elongase complex). Composé de quatre enzymes différentes ancrées au niveau de la membrane du réticulum endoplasmique (KCS, KCR, HCD et ECR), ce complexe effectue un cycle de quatre réactions permettant l’ajout de deux atomes de carbone au niveau de la chaine acyle de l’acide gras. La première réaction est effectuée par l’enzyme KCS, elle consiste en une condensation entre un acyl-CoA et un malonyl-CoA. A l’inverse des trois autres membres du complexe, l’enzyme KCS est caractérisée par une grande diversité génétique chez les plantes. 21 gènes codant pour cette enzyme ont notamment été identifiés chez Arabidopsis. La caractérisation fonctionnelle de certaines AtKCS a mis en évidence différentes spécificités de substrat, l’enzyme KCS déterminerait donc la sélectivité du complexe FAE vis-à-vis de substrats présentant différentes longueurs de chaînes.A ce jour, plusieurs AtKCS ont été étudiées pour leur implication dans les voies de biosynthèse de différents lipides tels que FAE1/KCS18 dans la synthèse de TAG au niveau des graines ou bien KCS6/CER6/CUT1 dans la synthèse de cires cuticulaires. Toutefois, il existe une redondance fonctionnelle entre les AtKCS co-exprimées dans différents tissus chez Arabidopsis, empêchant l’identification de leur rôle physiologique ainsi que de leur activité fonctionnelle. L’utilisation de la levure comme système d’expression hétérologue a également permis une caractérisation fonctionnelle partielle de la famille des AtKCS.L’objectif de cette thèse est de caractériser de façon plus approfondie la sélectivité de substrat et la redondance fonctionnelle des enzymes de condensation KCS d’Arabidopsis. Pour ce faire, une analyse fonctionnelle comparative englobant tous les membres de la famille multigénique des AtKCS a été effectuée via l’utilisation d’un système hétérologue de levure reconstituant le complexe FAE d’Arabidopsis dans son intégralité. Dans un deuxième temps, ce système de levure a été utilisé à nouveau pour l’étude de déterminants structuraux dans la spécificité de substrat entre certaines AtKCS partageant une forte homologie de séquence. Pour finir, les AtKCS d’un même cluster génétique ont été ciblées pour générer de multiples mutants kcs chez Arabidopsis et ainsi contourner leur redondance fonctionnelle afin d’élucider leur implication dans les voies de biosynthèse de différents lipides.

Very-long-chain fatty acids (VLCFA) are important molecules with crucial physiological and structural roles in plants. With acyl chains of 20 carbons or more, VLCFA can be modified into components of various important lipids such as phospholipids and sphingolipids of membranes, cuticular waxes in the epidermis, suberin in roots or triacylglycerols (TAGs) in seeds. Plant VLCFA are therefore involved in different mechanisms, such as membrane trafficking, cell division and differentiation, non-stomatal water loss prevention and energy storage, allowing plants to grow and adjust to their ever-changing environment.The elongation of VLCFA is performed by the Fatty Acid Elongase complex (FAE complex). This complex involves four distinct enzymes anchored to the ER membrane (KCS, KCR, HCD and ECR) and performs a four-steps reaction cycle adding two carbons to the growing fatty acyl chain. The KCS enzyme performs the first reaction consisting in a condensation between an acyl-CoA and a malonyl-CoA. Unlike the three other members of the FAE complex, the KCS enzyme is characterized by a high genetic diversity in plants, and 21 KCS genes have been identified in Arabidopsis. The functional characterization of few AtKCS highlighted different substrate specificities, suggesting that the chain length selectivity of FAE complexes is determined by its KCS enzyme.Few AtKCS isoforms have been investigated for their involvement in different lipid biosynthesis pathways in Arabidopsis such as FAE1/KCS18 in seed TAG biosynthesis or KCS6/CER6/CUT1 in cuticular waxes biosynthesis. However, functional redundancies between AtKCS co-existing within different Arabidopsis tissues prevent the clear identification of their physiological role, and the determination of the functional activity of a majority of these enzymes. Furthermore, using the yeast as heterologous expression system led to a partial functional characterization of AtKCS family.This PhD aimed to further characterize the variable chain length selectivity and the functional redundancy of Arabidopsis KCS condensation enzymes. To do so, a comparative functional analysis of the whole AtKCS family was performed using a yeast heterologous system reconstituting the complete Arabidopsis FAE complex. In a second time, we exploited this system and sequence homology between a few AtKCS to investigate the structural determinants of their substrate specificity. Finally, we tried to overcome the functional redundancy within one of the AtKCS gene clusters using multiple Arabidopsis kcs mutants to further investigate their role in different lipid biosynthetic pathways.