Évolution directée de la glucose oxidase à l'aide de microfluidiques à base de gouttelettes

Directed evolution of glucose oxidase using droplet-based microfluidics

• Auteur / Autrice : Alejandra Gadea Solidoro
• Direction : Jean-Christophe Baret
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Chimie et Technologies pour le vivant
• Date : Soutenance le 08/12/2022
• Etablissement(s) : Bordeaux
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale des sciences chimiques (Talence, Gironde ; 1991-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Centre de Recherche Paul Pascal (Pessac ; 1963-....)
• Jury : Président / Présidente : Cécile Zakri
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Patrice Soumillion, Valérie Taly

Mots clés

Mots clés contrôlés

Enzymes

Microfluidique

Génie génétique

Mots clés libres

Glucose oxydase

Évolution dirigée

Microfluidique

Génie génétique

Glucose oxidase

Directed evolution

Microfluidics

Genetic engineering

Résumé

La glucose oxydase (GOx) est une enzyme bien connue qui oxyde le glucose en présence d'oxygène en acide gluconique et en peroxyde d'hydrogène. Elle présente l'avantage que ces deux substrats sont des éléments largement présents dans la nature et dans le corps humain en particulier, ce qui la rend intéressante pour de nombreuses applications où l'on retrouve ces deux composants, notamment l'agroalimentaire, le suivi de la glycémie, les biopiles ou le traitement du cancer. Les biopiles à glucose peuvent être utilisées pour alimenter des dispositifs médicaux implantés car elles reposent sur l'utilisation de glucose et d'oxygène, tous deux présents dans les fluides corporels tels que le sang. La réaction chimique qui génère de l'énergie électrique se poursuit tant qu'il y a un apport de glucose et que l'enzyme reste active. Plus récemment, GOx a suscité de l'intérêt dans le cadre du traitement du cancer compte tenu des besoins en glucose dans l'environnement tumoral pour la croissance et le métabolisme. De plus, à son activité catalytique, GOx offre une biocompatibilité et une biodégradabilité, ce qui en fait une enzyme intéressante à améliorer par évolution dirigée ou génie génétique. L'évolution dirigée est une technique puissante de modification et d'amélioration des enzymes pour un large éventail d'applications industrielles et médicales. En imitant le mécanisme de l'évolution naturelle, on peut améliorer une propriété souhaitée en appliquant une pression de sélection appropriée et en sélectionnant des variantes améliorées. Cependant, être capable de trier les variantes intéressantes entre toute la diversité génétique a finalement été l'étape limitante de ce processus. Les systèmes microfluidiques à base de gouttelettes offrent une solution à haut débit à cette approche permettant l'analyse de variantes au sein de bibliothèques de plus en plus complexes, où la gouttelette agit comme un récipient de réaction à volume plus poli pour effectuer des essais biochimiques au niveau d'une seule cellule, reliant l'activité -phénotype - à sa variante enzymatique correspondante - le génotype - un facteur crucial dans l'évolution dirigée. De plus, la miniaturisation de l'échelle permet non seulement un débit plus élevé, mais réduit également la consommation de réactifs d'un million de fois, ce qui a un impact important sur le coût de l'ingénierie des protéines. Dans cette thèse, j'étudierai des méthodes pour améliorer la glucose oxydase pour des applications biomédicales en utilisant l'évolution dirigée et la microfluidique à base de gouttelettes. Ici, je cible d'abord l'expression hétérologue dans Gox de manière à pouvoir mesurer l'activité en microfluidique ainsi qu'en vrac et qui est compatible avec le flux de travail d'évolution dirigée. Ensuite, je vise à optimiser la production de Gox pour obtenir une protéine purifiée afin d'étudier ses propriétés. Enfin, je vise à améliorer sa stabilité dans des conditions physiologiques en gardant l'activité aussi élevée que possible. Dans ce chapitre, j'explore différentes méthodes pour créer de la diversité génétique en adaptant la technique et l'approche à chaque objectif, en me concentrant sur la stabilité oxydative, l'activité et la thermostabilité.

Glucose oxidase (GOx) is a well-known enzyme that oxidizes glucose in the presence of oxygen into gluconic acid and hydrogen peroxide. It has the advantage that these two substrates are elements widely present in nature and in the human body in particular, making it interesting for many applications where these two components are found, including food processing, glucose monitoring, biofuel cells or cancer treatment. Glucose biofuel cells can be used to power implanted medical devices since they rely on the use of glucose and oxygen, both present in body fluids such as blood. The chemical reaction that generates electrical power continues as long as there is supply of glucose and the enzyme remains active. More recently, GOx has aroused interest in the context of cancer treatment given the glucose requirement in the tumor environment for growth and metabolism. Additionally, to its catalytic activity, GOx offers biocompatibility and biodegradability, making it an interesting enzyme to improve using directed evolution or genetic engineering. Directed evolution is a powerful technique for modifying and improving enzymes for a wide range of industrial and medical applications. Mimicking the mechanism of natural evolution, one can enhance a desired property by applying a suitable selection pressure and selecting improved variants. However, being able to sort out the interesting variants in between all the genetic diversity has ultimately been the limiting step for this process. Droplet-based microfluidic systems offer a high-throughput solution to this approach allowing the analysis of variants within increasingly complex libraries, where the droplet acts as a politer-volume reaction vessel to perform biochemical assays at the single cell level, linking the activity -phenotype- to its corresponding enzyme variant -genotype- a crucial factor in directed evolution. Furthermore, miniaturizing the scale not only allows a higher throughput, but also decreases reagent consumption by a million-fold, having a great impact on the cost of protein engineering. In this thesis I will study methods to improve glucose oxidase for biomedical applications using directed evolution and droplet-based microfluidics. Here, I first target the heterologous expression in Gox in a way that I can measure the activity in microfluidics as well in bulk and that is compatible with the directed evolution workflow. Then, I aim to optimize the production of Gox to obtain a purified protein in order to study its properties. Finally, I aim to improve its stability at physiological conditions keeping the activity as high as possible. In this chapter I explore different methods to create genetic diversity adapting the technique and the approach to each objective, focusing on oxidative stability, activity and thermostability.