Thèse soutenue

Évolution directée de la glucose oxidase à l'aide de microfluidiques à base de gouttelettes
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Auteur / Autrice : Alejandra Gadea Solidoro
Direction : Jean-Christophe Baret
Type : Thèse de doctorat
Discipline(s) : Chimie et Technologies pour le vivant
Date : Soutenance le 08/12/2022
Etablissement(s) : Bordeaux
Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale des sciences chimiques (Talence, Gironde ; 1991-....)
Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Centre de Recherche Paul Pascal (Pessac ; 1963-....)
Jury : Président / Présidente : Cécile Zakri
Rapporteurs / Rapporteuses : Patrice Soumillion, Valérie Taly

Mots clés

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Mots clés contrôlés

Résumé

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La glucose oxydase (GOx) est une enzyme bien connue qui oxyde le glucose en présence d'oxygène en acide gluconique et en peroxyde d'hydrogène. Elle présente l'avantage que ces deux substrats sont des éléments largement présents dans la nature et dans le corps humain en particulier, ce qui la rend intéressante pour de nombreuses applications où l'on retrouve ces deux composants, notamment l'agroalimentaire, le suivi de la glycémie, les biopiles ou le traitement du cancer. Les biopiles à glucose peuvent être utilisées pour alimenter des dispositifs médicaux implantés car elles reposent sur l'utilisation de glucose et d'oxygène, tous deux présents dans les fluides corporels tels que le sang. La réaction chimique qui génère de l'énergie électrique se poursuit tant qu'il y a un apport de glucose et que l'enzyme reste active. Plus récemment, GOx a suscité de l'intérêt dans le cadre du traitement du cancer compte tenu des besoins en glucose dans l'environnement tumoral pour la croissance et le métabolisme. De plus, à son activité catalytique, GOx offre une biocompatibilité et une biodégradabilité, ce qui en fait une enzyme intéressante à améliorer par évolution dirigée ou génie génétique. L'évolution dirigée est une technique puissante de modification et d'amélioration des enzymes pour un large éventail d'applications industrielles et médicales. En imitant le mécanisme de l'évolution naturelle, on peut améliorer une propriété souhaitée en appliquant une pression de sélection appropriée et en sélectionnant des variantes améliorées. Cependant, être capable de trier les variantes intéressantes entre toute la diversité génétique a finalement été l'étape limitante de ce processus. Les systèmes microfluidiques à base de gouttelettes offrent une solution à haut débit à cette approche permettant l'analyse de variantes au sein de bibliothèques de plus en plus complexes, où la gouttelette agit comme un récipient de réaction à volume plus poli pour effectuer des essais biochimiques au niveau d'une seule cellule, reliant l'activité -phénotype - à sa variante enzymatique correspondante - le génotype - un facteur crucial dans l'évolution dirigée. De plus, la miniaturisation de l'échelle permet non seulement un débit plus élevé, mais réduit également la consommation de réactifs d'un million de fois, ce qui a un impact important sur le coût de l'ingénierie des protéines. Dans cette thèse, j'étudierai des méthodes pour améliorer la glucose oxydase pour des applications biomédicales en utilisant l'évolution dirigée et la microfluidique à base de gouttelettes. Ici, je cible d'abord l'expression hétérologue dans Gox de manière à pouvoir mesurer l'activité en microfluidique ainsi qu'en vrac et qui est compatible avec le flux de travail d'évolution dirigée. Ensuite, je vise à optimiser la production de Gox pour obtenir une protéine purifiée afin d'étudier ses propriétés. Enfin, je vise à améliorer sa stabilité dans des conditions physiologiques en gardant l'activité aussi élevée que possible. Dans ce chapitre, j'explore différentes méthodes pour créer de la diversité génétique en adaptant la technique et l'approche à chaque objectif, en me concentrant sur la stabilité oxydative, l'activité et la thermostabilité.