Imagerie 3D haut-débit du développement d’organoïdes par imagerie soSPIM

3D high-content screening imaging of organoid development using single objective SPIM

• Auteur / Autrice : Tom Delaire
• Direction : Jean-Baptiste Sibarita, Virgile Viasnoff
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Neurosciences
• Date : Soutenance le 24/11/2022
• Etablissement(s) : Bordeaux
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Sciences de la vie et de la santé (Talence, Gironde ; 1993-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut Interdisciplinaire de Neurosciences (Bordeaux)
• Jury : Président / Présidente : Pierre-François Lenne
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Pierre-François Lenne, Corinne Lorenzo, Alexandra Fragola, Gaëlle Recher
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Corinne Lorenzo, Alexandra Fragola

Mots clés

Mots clés contrôlés

Criblage pharmacologique

Cultures cellulaires

Spectroscopie -- Déconvolution

Imagerie tridimensionnelle

Mots clés libres

Microscopie à feuille de lumière

Cultures cellulaires 3D

Criblage haut-Débit

Imagerie 3D en direct

Déconvolution

Imagerie Multi-vues

Light sheet microscopy

3D cell cultures

High-Content Screening

3D live imaging

Deconvolution

Multiview Imaging

Résumé

Au cours des dernières décennies, les cultures cellulaires 3D sont devenues une référence pour les essais de médicaments et la mesure de toxicité. Elles englobent un large éventail d'échantillons, allant des sphéroïdes dérivés d'une seule lignée cellulaire, jusqu’aux organoïdes formés à partir de cellules souches qui se développent en structures multicellulaires semblables à des organes, reproduisant toute ou partie de la morphologie et des fonctions des organes humains. L’étude du développement de ces cultures est particulièrement intéressante du fait qu’elles imitent fidèlement les comportements observés in vivo, contrairement à leurs homologues 2D encore massivement utilisés aujourd’hui. Elles pourraient également permettre de réduire le nombre d’expériences effectuées sur des animaux qui est un sujet de nombreux débats d’éthiques. Pour y parvenir, le développement d’outils expérimentaux capables de les étudier est encore nécessaire. C’est le cas du criblage haut-débit, une méthode s’appuyant sur l’étude automatisée d’un important nombre d’échantillons, dont l’utilisation dans le cadre de cultures 3D nécessite de relever les défis suivants : i) standardiser et paralléliser la culture d’échantillons 3D, tout en minimisant leurs manipulations; ii) intégrer des méthodes de microscopie 3D rapides et peu invasives pour suivre l’évolution d’un grand nombre d’échantillons dans le temps, tout en préservant leur intégrité biologique ; iii) être compatible avec les protocoles de criblage haut-débit dans le but de générer rapidement un grand nombre de données statistiques pour en extraire les informations pertinentes ; iv) intégrer des outils informatiques dédiés, nécessaires à l'analyse phénotypique de la masse de données générées. Pour atteindre ces objectifs, notre équipe, en collaboration avec le MechanoBiology Institute de Singapour, a développé un système de microscopie à feuille de lumière à objectif unique, appelée soSPIM. Cette méthode d'imagerie repose sur des dispositifs micro-fabriqués composés de micromiroirs orientés à 45° permettant de créer une feuille de lumière perpendiculaire à l’axe optique du microscope, et de collecter la fluorescence avec le même objectif. Cette architecture, compatible avec n’importe quel microscope inversé, supprime les contraintes mécaniques des microscopes à feuille de lumière standards multi-objectifs. De nouveaux dispositifs comprenant des microcavités en forme de pyramides tronquées, appelés JeWells, ont récemment été mis au point. Ils permettent de paralléliser et de standardiser la culture et l’imagerie soSPIM de centaines d'échantillons 3D dans un seul dispositif. Mon projet de thèse s’inscrit dans le cadre du développement d’une plateforme innovante de criblage à haut débit de cultures cellulaires 3D en utilisant la technologie soSPIM. J'ai dans un premier temps développé des outils et des protocoles pour automatiser le processus d'acquisition, ainsi que pour faciliter la prise en main de l’instrument. J'ai en particulier développé un logiciel de repositionnement automatique, permettant de stabiliser et paralléliser le criblage 3D d'échantillons sur plusieurs jours. Dans un second temps, j’ai implémenté différentes méthodes d'amélioration des images soSPIM, telles que l'imagerie multi-vues, la déconvolution ou le sectionnement optique par illumination structurée, dans le but d’optimiser la qualité des images obtenues et d’améliorer les performances des algorithmes de quantification.

Over the last decades, 3D cell cultures have emerged as future gold standards for drug screening and toxicity assays. 3D cell cultures encompass a wide range of samples, ranging from spheroids derived from a single cell line, to organoids derived from stem cells that develop into multicellular organ-like structures, reproducing part of the morphology and functions of human organs. Investigating the development of these 3D cultures is particularly interesting because they faithfully mimic the behaviors observed in vivo, contrary to their 2D counterparts still massively used nowadays. They could also help reducing the number of experiments performed on animals, which is a subject of numerous ethical debates. To achieve this, there is a need to develop dedicated experimental tools, such as high-throughput screening, which is an analysis method based on the automated study of a large number of samples. Their adaptation for 3D cell cultures still poses many challenges, such as: (i) to standardize and parallelize the culture of the 3D samples, while minimizing their manipulation; (ii) to use fast and noninvasive 3D imaging methods to monitor the development of a high number of samples over time, while preserving their biological integrity; (iii) to be compatible with high-content screening protocols to provide sufficient statistics for robust and relevant information extraction; (iv) to integrate dedicated analytical tools for the systematic phenotypic analysis of large data-sets.To reach these goals, our team, in collaboration with the MechanoBiology Institute in Singapore, have developed the single-objective light-sheet microscopy technology (soSPIM). This imaging method relies on micro-fabricated devices integrating 45° micro-mirrors to create a sheet of light perpendicular to the optical axis of the microscope, and to collect the fluorescence with only one objective. Compatible with any inverted microscope, this architecture removes the mechanical constraints of the standard multi-objectives light-sheet microscopes. New devices called JeWells, composed of truncated pyramidal shaped micro-cavities, have been recently developed. They allow to parallelize and standardize the culture and soSPIM imaging of hundreds of 3D samples within a single chip.My PhD project aims to develop an innovative platform for 3D high-content screening of 3D cell cultures using the soSPIM technology. I first developed several tools and protocols to automatize the acquisition process and facilitate the handling of the system. In particular, I developed an automatic repositioning software to stabilize and parallelize the 3D screening of samples over days. Second, I implemented several image improvement methods for soSPIM, such as multiview imaging, deconvolution, or optical sectioning by structured illumination, to optimize the quality of the images and improve the performances of the quantification pipeline.