Evaluation du risque d’instabilité génomique induite par CRISPR-Cas9 et optimisation du système pour une édition plus sûre et efficace

CRISPR-Cas9 genomic instability risk evaluation and system optimisation for safe and efficient genome editing

• Auteur / Autrice : Juliette Rosier
• Direction : François Moreau-Gaudry
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Génétique
• Date : Soutenance le 12/12/2022
• Etablissement(s) : Bordeaux
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Sciences de la vie et de la santé (Talence, Gironde ; 1993-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : BordeAux Research In Translational Oncology (2016-2021)
• Jury : Président / Présidente : Benoît Arveiler
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Benoît Arveiler, Els Verhoeyen, Mario Amendola, Erika Brunet
• Jury : Rapporteur / Rapporteuse : Els Verhoeyen, Mario Amendola

Mots clés

Mots clés contrôlés

Toxicologie génétique

Quiescence cellulaire

CRISPR-Cas9

Thérapie génique

Mots clés libres

Thérapie génique

Édition génique

CRISPR-Cas9

Instabilité génomique

Globine

Perte d’hétérozygotie copie-neutre

Quiescence

Import nucléaire de la matrice HDR

Gene therapy

GeGenome editing CRISPR-Cas9

Genomic instability

Globin

Copy neutral loss-of-heterozygosity

Quiescence

HDR template nuclear import

Résumé

L’outil d’édition du génome CRISPR-Cas9 est extrêmement puissant et promet un avenir remarquable en thérapie génique. Toutefois, introduire une cassure double brin dans le génome n’est pas sans risque et peut conduire à des évènements indésirables. En effet, la survenue de modifications non-souhaitées au locus ciblé et l’apparition de sous-produits génère une génotoxicité on-target. Dans une première partie, nous nous sommes intéressés à évaluer le risque d’instabilité génomique induit par CRISPR-Cas9 dans des cellules pertinentes en clinique sur un locus d’intérêt thérapeutique. Nous avons mis en évidence une forme de génotoxicité on-target à large échelle et étudié les conséquences fonctionnelles. Dans une deuxième partie, nous avons cherché à diminuer le risque de survenue de larges réarrangements en modulant la division cellulaire. Nous avons montré que la quiescence des cellules au moment de la cassure double brin les protégeait contre l’apparition de réarrangements génomiques. Dans une dernière partie, nous nous sommes focalisés sur la génotoxicité on-target la plus fréquente, les insertions et délétions induites lors de la réparation par NHEJ quand une correction précise par HDR est souhaitée. Nous avons conçu un système d’import nucléaire de la matrice de correction HDR pour maximiser le ratio modifications précises/imprécises. L’évaluation du risque lié à l’utilisation de CRISPR-Cas9 et l’optimisation de l’outil et de ses alternatives sont cruciaux pour permettre son utilisation clinique la plus adéquate.

The CRISPR-Cas9 genome editing tool is extremely powerful and promises a remarkable future in gene therapy. However, introducing a double-strand break into the genome is not without risk and can lead to adverse events. Indeed, the occurrence of undesired modifications at the targeted locus and the appearance of by-products generate the on-target genotoxicity. In a first part, we assessed the risk of genomic instability induced by CRISPR-Cas9 in clinically relevant cells on a locus of therapeutic interest. We have shown a form of large scale on-target genotoxicity and studied the functional consequences. In a second part, we aimed to reduce the risk of occurrence of large rearrangements by modulating cell division. We have demonstrated that cells in a quiescent state at the time of the double-strand break were protected from the appearance of genomic rearrangements. In a last part, we focused on the most frequent on-target genotoxicity, the NHEJ-induced insertions and deletions, when a precise correction by HDR is intended. We have designed a HDR template nuclear import system to maximize the ratio of precise/imprecise modifications. Assessing the risk linked to the use of CRISPR-Cas9 and the optimisation of the technology as well as its alternatives are crucial for safe and efficient genome editing.