Métagénomique ciblée pour le diagnostic d’infection bactérienne.

Targeted metagenomics for diagnosis of bacterial infection.

• Auteur / Autrice : Laure Flurin
• Direction : Michel Carles, Sébastien Breurec, Robin Patel
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Aspects moleculaires et cellulaires de la biologie
• Date : Soutenance le 30/06/2022
• Etablissement(s) : Antilles
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Milieu insulaire tropical à risques : protection, valorisation , santé et développement (Pointe-à-Pitre)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Mayo clinic (Rochester, Minn)
• Jury : Président / Présidente : Raymond Césaire
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Michel Carles, Sébastien Breurec, Robin Patel, Raymond Césaire, Laurent Boyer, Damien Roux, Bruno Hoen, Faten El Sayed
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Laurent Boyer, Damien Roux

Mots clés

Mots clés contrôlés

Projet Génome humain

Métagénomique

Microbiologie

Mots clés libres

Métagénomique ciblée (tNGS)

Séquençage de nouvelle génération (NGS)

PCR de l'ARNr 16S

Séquençage Sanger

Métagénomique non ciblée (sNGS)

Targeted metagenomics (tNGS)

Next Generation sequencing (NGS)

16S rRNA PCR

Sanger sequencing

Shotgun metagenomics (sNGS)

Résumé

Introduction: Le diagnostic d'une infection repose encore souvent sur les cultures conventionnelles de micro-organismes, ce qui entraîne un délai de résultat plus long et une faible sensibilité en cas d'utilisation antérieure d'antibiotiques ou de pathogène difficile à cultiver. Les méthodes moléculaires peuvent contourner les limitations ci-dessus en détectant directement l'ADN des micro-organismes dans un échantillon. La réaction en chaîne par polymérase (PCR) spécifique ou multiplex offre une alternative seulement si une idée prédéfinie du diagnostic a été faite. La PCR 16S suivie du séquençage Sanger a été utilisée comme méthode de diagnostic au cours des dernières décennies, mais en complément en cas de culture négative plus que comme technique alternative aux cultures. La limite principale du séquençage Sanger est qu’il ne peut détecter qu'une seule séquence à la fois, ce qui limite sa sensibilité et sa capacité à détecter plusieurs organismes par échantillon. En revanche, le séquençage nouvelle génération (NGS) peut amplifier des millions de fragments à la fois, permettant une détection plus sensible des pathogènes en particulier pour les échantillons négatifs en culture ou polymicrobiens. Objectif : Dans ce travail, nous évaluons 1) l’apport de l’implémentation du NGS dans les tests de routine et sa performances pour le diagnostic d'infection bactérienne dans les tissus et les liquides organiques provenant de sites normalement stériles; 2) l’utilisation du NGS pour l’identification des agents pathogènes dans le liquide synovial et le liquide de sonication de patients souffrant d'infections de prothèses articulaires (PJI); 3) l’utilisation du NGS pour le diagnostic microbiologique dans le sang et le plasma de patients atteints d'endocardite infectieuse (IE). Methodes : Nous nous sommes principalement concentrés sur une approche de métagénomique ciblée en utilisant l’amplification par PCR du gène de l'ARN ribosomal 16S, avant de séquencer l’ADN amplifié sur un outil de NGS, le MiSeqTM (Illumina). L’analyse bioinformatique a été faite sur RipSeq, Pathogenomix. Resultats : Dans les tissus et les liquides organiques, la sensibilité clinique de la métagénomique ciblée était plus élevée que celle des cultures, en particulier chez les patients ayant reçu un traitement antimicrobien préalable. Pour le diagnostic d’infection de prothèse ostéo-articulaire, la sensibilité de métagénomique ciblée dans le liquide synovial n’était pas augmentée par rapport à la sensibilité des cultures. Néanmoins, dans une étude portant sur 105 échantillons de liquide de sonication provenant de patient porteurs d’une prothèse totale de coude, la métagénomique ciblée avait une sensibilité clinique de 85 % contre 77 % pour les cultures. Dans le cas de l'endocardite infectieuse, un agent pathogène a été détecté dans 18/29 (62%) des IE à hemocultures positives et 5/6 (83%) des IE à hémocultures négatives.Conclusion:. Nous avons démontré l’utilité de la métagénomique ciblée pour la détection d’agents pathogènes sur les tissus et liquides biologiques en examen de routine, ainsi que dans le diagnostic d’infection de prothèses ostéo-articulaires et de l’endocardite infectieuse. Nos résultats ouvrent la perspective d’une application technique en routine, indépendante des cultures et avec une meilleure sensibilité que ces dernières dans un temps imparti théorique de 48h.

Introduction : Diagnosis of infection still oftentimes relies on conventional cultures of microorganisms, resulting in longer result delay and poor sensitivity in case of previous use of antibiotics difficult-to-grow pathogens. Molecular methods may circumvent the above limitations by detecting microorganism DNA in samples. Next generation sequencing (NGS) can amplify millions of DNA fragments at once, and thus makes a perfect candidate for diagnostic, especially for culture-negative specimens and polymicrobial samples.Objectives : In this work, 1) we evaluate the additional value of 16S rRNA gene-based PCR followed by Sanger sequencing or NGS in routine testing and its performance for diagnostic of bacterial infection in tissues and body fluids from normally sterile sites. Then, 2) we investigated its use for pathogen identification in synovial fluid and sonicate fluid from patients suffering from Prosthetic Joint Infections (PJI), as well as 3) in blood and plasma in patients with Infective Endocarditis (IE). Methods : We focus on a targeted metagenomics approach using 16S rRNA gene-based PCR as an amplification step before performing NGS on a MiSeqTM (Illumina). Bioinformatics analysis was done using Ripseq, Pathogenomix software. Results : In tissues and body fluids the clinical sensitivity of targeted metagenomics was higher than cultures especially in patients who had received antimicrobial therapy. For diagnosis of PJI, tNGS was not superior to cultures in synovial fluid. However, in a study on 105 sonicate fluids from elbow arthroplasty failures, targeted metagenomics had a clinical sensitivity of 85% compared to 77% for cultures. In IE, pathogens were detected in whole blood and plasma, in 18 out of 29 (62%) blood culture-positive cases and 5 out of 6 (83%) BCNE.Conclusion : tNGS is useful for bacterial diagnosis in routine microbiology as well as in PJI and IE, especially in culture-negative infection and patients who had received antimicrobial therapy