Diversité des polygalacturonases d'Arabidopsis thaliana : mode d'action et effets sur le développement de la racine et de l'hypocotyle

Diversity of polygalacturonases from Arabidopsis thaliana : mode of action and effects on the development of roots and hypocotyls

• Auteur / Autrice : Wafae Tabi
• Direction : Jérôme Pelloux, Valérie Lefebvre
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie. Biologie Cellulaire et Moléculaire, Biotechnologies Végétales
• Date : Soutenance le 28/06/2022
• Etablissement(s) : Amiens
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Sciences, technologie et santé (Amiens)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Biologie des Plantes et Innovation (Amiens ; 2011-....)
• Jury : Président / Présidente : Olivier Van Wuytswinkel
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Tom Beeckman, Sophie Le Gall
• Jury : Rapporteur / Rapporteuse : Stéphanie Robert, Christophe D' Hulst

Mots clés

Mots clés contrôlés

Cytologie du développement

Polygalacturonase

Développement

Arabidopsis thaliana

Mots clés libres

Homogalacturonanes (HGs)

Polygalacturonases (PGs)

Oligogalacturonides (OGs)

Adhésion cellulaire

Elongation cellulaire

Cell adhesion

Cell elongation

Résumé

Les pectines, qui constituent 30% de la paroi primaire végétale, régulent les propriétés mécaniques de la paroi, contribuent à l'adhésion cellulaire ainsi qu'à la croissance des plantes. Les homogalacturonanes (HGs), composants majoritaires des pectines, sont constitués de longues chaînes d'acides galacturoniques, qui peuvent être méthylestérifiées et/ou acétylées. Les changements dans la structure des HGs sont médiés par l'activité d'enzymes telles que les polygalacturonases (PGs) qui, en hydrolysant les liaisons α 1,4 des HGs, produisent des oligogalacturonides (OGs), de différents degrés de polymérisation et de substitution. Chez Arabidopsis thaliana, 68 gènes codent pour des PGs, ce qui complexifie l'étude de leurs fonctions via des mutants, du fait de mécanismes de compensation génique. Afin de mieux comprendre les différences de spécificité de ces enzymes, quatre PGs, PGLR, ADPG2, VPG1 et VPG2, dont les gènes sont co-exprimés dans la racine, ont été étudiées. Les enzymes ont été exprimées en système hétérologue, purifiées et caractérisées biochimiquement. Les spécificités de substrat, de pH et de température diffèrent légèrement entre les enzymes. Une méthode de profilage des OGs a ensuite été utilisée, révélant que, bien que les quatre enzymes soient des endo-PGs, le profil des OGs libérés diffère, suggérant des processivités distinctes. Une stratégie d'application exogène des enzymes purifiées sur modèle végétal a été mise en place afin de comprendre les conséquences de l'action de ces différentes isoformes sur le développement. L'ajout de PGLR et d'ADPG2 purifiées dans le milieu de culture des graines d'Arabidopsis thaliana, provoque un défaut d'allongement des hypocotyles étiolés ainsi que des pertes d'adhésion cellulaire. Les deux enzymes, bien que provoquant des phénotypes similaires, se distinguent par l'intensité des phénotypes observés : en comparaison de PGLR, ADPG2 provoque également un défaut d'allongement des racines primaires. En revanche, VPG1 et VPG2 n'induisent aucun phénotype. La comparaison des structures tridimensionnelles de PGLR et ADPG2, obtenues par diffraction aux rayon X, a permis de montrer que, si les deux enzymes possèdent un site actif très conservé, des différences de structure des sous-sites et de la dynamique des enzymes en complexe avec leurs substrats peuvent expliquer leurs processivités particulières, et les phénotypes distincts qu'elles engendrent. De plus, l'analyse détaillée de la mise en place des phénotypes induits par PGLR a permis de relier son action aux conséquences qu'elle entraine sur le développement. En effet, PGLR, en agissant uniquement sur les cellules en élongation, induit une modification de la structure des pectines, des propriétés mécaniques de la paroi et de l'expression de gènes codant notamment des enzymes de remodelage des pectines et des protéines/enzymes impliquées dans la signalisation. L'ensemble des travaux permet ainsi de montrer que, au sein d'une famille multigénique, des spécificités enzymatiques fines contribuent à une modulation fine de la structure des pectines in planta

Pectins which make up 30% of the primary cell wall, contribute to the mechanical properties of the cell wall, cell adhesion and plant growth. Homogalacturonans (HG), the most abundant pectic domain, are composed of long chain of galacturonic acids, that can be methylesterified and/or acetylated. Changes in HG structure are mediated by the activities of polygalacturonases (PGs) which, by hydrolysing the α 1,4 bonds of HGs, produce oligogalacturonides (OGs), of different degrees of polymerisation and substitution. In Arabidopsis thaliana, 68 genes encode PGs, which further complexifies the study of their functions via mutant approaches, due to gene compensation mechanisms. To further understand the differences in the specificities of these enzymes, four PGs, PGLR, ADPG2, VPG1 and VPG2, whose genes are co-expressed in roots, were characterized. The enzymes were expressed in heterologous system, purified and biochemically characterized. We first showed that substrate, pH and temperature specificities differ slightly between enzymes. An OG profiling method has been used, revealing that, although the four enzymes are bona fide endo-PGs, the profile of released OGs differed, suggesting distinct processivities. A strategy of exogenous application of purified enzymes has been used to understand the consequences of the action of these different isoforms on plant development. Purified PGLR and ADPG2, added in the germination medium of Arabidopsis thaliana, impaired cell elongation of etiolated hypocotyls as well as induced cell detachment. However, PGLR and ADPG2, differed in the intensity of the phenotypes they convey: in comparison to PGLR, ADPG2 also causes a strong defect in primary root elongation. In contrast, VPG1 and VPG2 did not induce any visible defects, suggesting that distinct processivities may translate into different phenotypes. The comparison of the 3D structures of the two enzymes, obtained by X-ray diffraction, showed that, if PGLR and ADPG2 have a very conserved active site, differences in the structure of their subsites and the dynamics of the enzymes in complexes with substrates may explain their differences in processivity, which lead to distinct phenotypes. In addition, the detailed phenotypic study of the application of PGLR enabled linking its action to the consequences on development. Indeed, PGLR, by acting only on elongating cells, induced modifications in the structure of pectins, in the mechanical properties of the cell wall and in the expression of genes encoding both pectin remodelling enzymes and proteins/enzymes involved in signalling. Altogether, these results show that, within PG multigenic family, peculiar enzymatic specificities contribute to the fine modulation of the structure of pectins in planta and ultimately to the control of plant development