Imagerie de la transcription en temps réel pour étudier la perception du phosphate chez les plantes

Real-time imaging of transcription to study phosphate sensing in plants

• Auteur / Autrice : Sahar Hani
• Direction : Laurent Nussaume
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie végétale
• Date : Soutenance le 27/06/2022
• Etablissement(s) : Aix-Marseille
• Ecole(s) doctorale(s) : École Doctorale Sciences de la Vie et de la Santé (Marseille)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut de biosciences et biotechnologies d'Aix-Marseille
• Jury : Président / Présidente : Stefano Caffarri
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Cécile Raynaud, Norbert Rolland, Édouard Bertrand
• Jury : Rapporteur / Rapporteuse : Sandra Cortijo, Gabriel Krouk

Mots clés

Mots clés contrôlés

Polyploïdie

Microfluidique

Homéostasie

Phosphates

Mots clés libres

Imagerie

In vivo

Transcription

Phosphate

Plante

Imaging

In vivo

Transcription

Plant

Phosphate

Résumé

Le phosphate (Pi) est un macronutriment essentiel au développement des plantes. Les plantes ont développé des réponses adaptatives à la carence en Pi, impliquant une régulation fine de la transcription de plusieurs gènes impliqués dans son homéostasie. Afin d'accéder à la cinétique de la transcription in vivo, nous avons développé une technique d'imagerie d’ARN basée sur le système MS2-MCP. Des séquences d'ARN bactériennes sont introduites dans le transcrit ciblé. Elles sont reconnues par une protéine virale fusionnée à une GFP, qui s'agglomère sur l'ARNm, permettant de le visualiser. Nous avons marqué des gènes précoces de la carence en Pi (SPX1, Uni1) avec la MS2/MCP et l’avons combiné avec la microfluidique. Ceci a permis de suivre en temps réel l’impact du signal Pi dans les tissus, avec une résolution spatio-temporelle sans précédent. La potentialité de la technique a été validée par smFISH. Nous avons constaté que la répression de SPX1 déclenchée par le Pi dans les racines se produit rapidement (~5 min), avec une hétérogénéité entre les cellules voisines. Nous avons observé de la transcription stochastique et constaté que les allèles actifs ont des fréquences d’initiation de transcription élevées et se regroupent souvent dans les cellules polyploïdes. En conclusion, ce système constitue un outil polyvalent permettant d'approfondir les connaissances physiologiques sur l'absorption et l’utilisation du Pi.Les techniques mises en œuvre permettent d’aborder de multiples questions physiologiques. De plus, elles donnent accès à la dynamique de l'ARN PolII ce qui peut bénéficier à des études liées à la transcription (bursting, gene silencing, hétérogénéité tissulaire..)

Phosphate (Pi) is an essential macronutrient for plant development. Plants have evolved adaptational responses to Pi-scarcity, implicating fine tuning of the spatial and temporal transcription of several genes involved in Pi-homeostasis. In order to access transcription kinetics in vivo we developed an RNA-tagging and imaging technique based on the MS2-MCP system. It makes use of specific bacterial RNA sequences that are introduced in the targeted transcript. These are recognized by a viral protein fused to a GFP, which agglomerates on the mRNA, enabling its visualization. We tagged early markers (SPX1, Uni1) of Pi starvation with the MS2/MCP and combined it with root microfluidics. This allowed to follow, in real-time, the propagation of the Pi-signal and its impact in plant tissues, with unprecedented spatio-temporal resolution. The potentiality of the approach was validated by smFISH. We found that the repression of SPX1 triggered in roots by Pi occurs with unexpectedly fast kinetics (~5 min), with striking heterogeneity between neighbouring cells. We also observed gene bursting and found that active alleles have high transcription rates and frequently cluster together in polyploid cells. In conclusion, this system constitutes a versatile tool allowing to expand the physiological knowledge on the absorption and use of Pi, as well as decipher the molecular mechanisms taking place in response to Pi-deficiency. In general, the techniques implemented broaden perspectives in tackling many physiological questions. Additionally, they grant access to RNA polII dynamics which can benefit transcription related studies such as bursting, gene silencing, tissue heterogeneity..