Vers la sélection de biocatalyseurs à l'aide de programmes moléculaires distribués par microfluidique

Towards biocatalyst selection using microfluidically distributed molecular programs

• Auteur / Autrice : Vasily Shenshin
• Direction : Yannick Rondelez
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biochimie
• Date : Soutenance le 29/01/2021
• Etablissement(s) : Université Paris sciences et lettres
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Médicament, toxicologie, chimie, imageries (Paris ; 2014-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Gulliver (Paris) - Gulliver (Paris)
• Partenaire(s) de recherche : établissement opérateur d'inscription : Ecole supérieure de physique et de chimie industrielles de la Ville de Paris (1882-....)
• Jury : Président / Présidente : Gilles Truan
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Yannick Rondelez, Karen M. Polizzi, Philippe Nghe
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Gilles Truan, Karen M. Polizzi

Mots clés

Mots clés libres

Programmation moléculaire

Facteur de transcription allostérique

Détection de petites molécules

Évolution dirigée

Molecular programming

Allosteric transcription factor

Small molecule sensing

Directed evolution

Résumé

Les circuits moléculaires in vitro, basés sur des chimies programmables par ADN, peuvent remplir une gamme croissante de fonctions de haut niveau. Cependant, la plupart des démonstrations ne peuvent accepter que des acides nucléiques comme signaux d'entrée. Dans cette thèse, nous introduisons une stratégie générale pour interfacer les circuits basés sur l'ADN avec des signaux non ADN, stratégie basée sur des modules de traduction d'entrée. Nous concevons ces modules pour qu'ils soient réglables et modulaires. Ils peuvent être utilisés pour transmettre ou inverser la réponse associée à la présence d'une petite molécule donnée. Ceci est démontré en les combinant pour construire des circuits de détection qui fournissent une réponse temporelle quantitative fluorescente à la concentration d’entrée, avec une bonne spécificité et sensibilité.La programmabilité de la couche d'ADN est exploitée pour effectuer une inversion logique, une modulation de signal et une tâche de classification sur deux entrées. Nous démontrons également la compatibilité avec les conditions biochimiques standard en effectuant une détection intégrée « one-pot » d'une enzyme grâce à son activité métabolique native. Ceci est approfondi en ajoutant une sortie PCR au circuit.Nous prévoyons que cette stratégie sensible de conversion de petites molécules en ADN jouera un rôle essentiel dans les futures applications des circuits au niveau moléculaire, y compris les méthodes de crible fonctionnel et d'évolution dirigée in vitro.

In vitro molecular circuits, based on DNA-programmable chemistries, can perform an increasing range of high-level functions. However, most reported demonstrations can only accept nucleic acid as input signals. In this thesis, we introduce a general strategy to interface DNA-based circuits with non-DNA signals, based on input-translating modules. We design these modules to be tunable and modular. They can be repurposed to either transmit or invert the response associated with the presence of a given input. This is demonstrated by combining them to build sensing circuits that provide a fluorescent quantitative time-response to the concentration of their small-molecule input, with good specificity and sensitivity.The programmability of the DNA layer is leveraged to perform logical inversion, signal modulation and a classification task on two inputs. We also demonstrate compatibility with standard biochemical conditions by carrying out one-pot detection of an enzyme through its native metabolic activity. This is taken further by adding PCR output to the circuit.We anticipate that this sensitive small-molecule-to-DNA conversion strategy will play a critical role in the future applications of molecular-level circuitry, including functional screens and in vitro directed evolution methods.