Microscopie à fluorescence sélective et volumétrique pour la localisation de molécules uniques dans des environnements encombrés

Selective and volumetric fluorescence microscopy for single-molecule localization in crowded environments

• Auteur / Autrice : Tommaso Galgani
• Direction : Bassam Hajj, Maxime Dahan
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Physique
• Date : Soutenance le 29/10/2021
• Etablissement(s) : Université Paris sciences et lettres
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Physique en Île-de-France (Paris ; 2014-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Physique des Cellules et Cancer (Paris ; 2024-....) - Laboratoire Physico-Chimie Curie [Institut Curie] / PCC
• Partenaire(s) de recherche : établissement opérateur d'inscription : Institut Curie (Paris ; 1978-....)
• Jury : Président / Présidente : Sandrine Lévêque-Fort
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Bassam Hajj, Maxime Dahan, Sandrine Lévêque-Fort, Aleksandra Radenovic, Ricardo Henriques, Jean-Baptiste Sibarita, Antoine Coulon
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Aleksandra Radenovic, Ricardo Henriques

Mots clés

Mots clés libres

Feuille de lumière

Molécule unique

Imagerie 3D

Super-Résolution

Dynamique

Noyau

Light-Sheet

Single-Molecule

3D imaging

Super-Resolution

Dynamics

Nucleus

Résumé

L'imagerie de la molécule unique (SM) offre un moyen d'étudier l'organisation et la dynamique des biomolécules avec une haute résolution temporelle et spatiale. Cependant, l’imagerie avec une faible profondeur de champ d'un microscope standard ne reflète pas l'organisation volumétrique internes des cellules et limite la gamme des dynamiques qui peuvent être observées en 3D. La réalisation d'une imagerie SM efficace et précise dans un échantillon biologique volumétrique est confrontée à deux défis principaux. Premièrement, les molécules excitées hors foyer produisent un bruit de fond élevé qui affecte la précision de localisation. Deuxièmement, les molécules qui diffusent rapidement ont tendance à s’échapper à la profondeur de champ d'imagerie. Pour relever ces défis, nous proposons une nouvelle méthode d'imagerie volumétrique sélective et instantanée avec une sensibilité SM. Dans le cadre de mon projet de doctorat, nous avons développé un système modulaire inspiré de deux techniques de pointe : la microscopie multifocale (MFM) et la microscopie sélective à feuille de lumière et à objectif unique (soSPIM). Grâce au MFM, notre système est capable d'imager instantanément un volume avec une haute résolution temporelle et une sensibilité SM. Nous avons l'architecture du soSPIM afin de créer une excitation en nappe de lumière uniforme et accordable qui s’adapte à la profondeur d’imagerie du MFM. Nous avons illustré l'avantage de notre méthode par l’imagerie de la dynamique des facteurs nucléaires tels que H2B, CTCF et Cohesin à plusieurs microns de profondeur dans des cellules U2OS et cellules souches embryonnaires de souris avec une haute résolution temporelle et spatiale. Nous avons pu imager la dynamique des SM jusqu'à 50 volumes de 35×35×4 μm3 par seconde. Enfin, nous avons reconstruit des images volumétriques en super-résolution de Lamine-b, une protéine de la membrane nucléaire, par DNA-PAINT. Cette thèse ouvre la voie à l’observation de l'organisation et de la dynamique moléculaires à haute résolution temporelle et spatiale dans des organismes multicellulaires et des tissus.

Single-molecule (SM) imaging offer a mean to investigate the nanoscale organization and dynamics of biomolecules with high temporal and spatial resolution. However, the limited imaging depth of a standard SM microscope does not reflect the inherent volumetric organization of the inner organelles of cells and limits the range of SM dynamics that can be observed in 3D. Performing efficient SM imaging with high localization precision in a volumetric biological sample faces two main challenges. First, excited out-of-focus molecules produce high background noise that affect the localization precision. Second, fast diffusing molecules tend to escape the limited depth of field of the imaging microscope objective. To address these challenges, we propose a new method for selective and true instantaneous volumetric imaging with SM sensitivity. In my PhD project, we developed a modular system, with, at the core, two cutting-edge techniques: multifocus microscopy (MFM) and single-objective selective plane illumination microscopy (soSPIM). Thanks to the MFM, our system is able to image instantaneously a volume with high temporal resolution and SM sensitivity. We remodeled the soSPIM architecture in order to create a tunable and uniform light sheet excitation that matches the desired range of detection with MFM. We illustrated the advantage of our method by imaging the dynamics of nuclear factors such as H2B, CTCF and Cohesin at several microns deep in U2OS and mouse embryonic STEM cells with high temporal and spatial resolution. We were able to image SM dynamics up to 50 volumes of 35×35×4 μm^3 size per second. Finally, we reconstructed volumetric super-resolution images of the nuclear membrane, performing DNA-PAINT on the Lamin-b protein. This thesis paves the way for exploring the molecular organization and dynamics at high temporal and spatial resolution in multicellular organisms and tissues.