Etude et réalisation d’un microdispositif magnéto-fluidique pour la capture et la détection de cytokines modèles TNF-α en fluorescence
Auteur / Autrice : | Etienne Laborie |
Direction : | Elisabeth Dufour-Gergam, Mehdi Ammar, Claire Smadja |
Type : | Thèse de doctorat |
Discipline(s) : | Electronique et Optoélectronique, Nano et Microtechnologies |
Date : | Soutenance le 16/07/2021 |
Etablissement(s) : | université Paris-Saclay |
Ecole(s) doctorale(s) : | École doctorale Electrical, optical, bio-physics and engineering |
Partenaire(s) de recherche : | référent : Faculté des sciences d'Orsay |
Laboratoire : Centre de nanosciences et de nanotechnologies (Palaiseau, Essonne ; 2016-....) - Institut Galien Paris-Saclay (Châtenay-Malabry, Hauts-de-Seine ; 1998-....) | |
Jury : | Président / Présidente : Benoît Piro |
Examinateurs / Examinatrices : Benoît Charlot, Carole Chaix, Isabelle Turbica, Bruno Le Pioufle | |
Rapporteurs / Rapporteuses : Benoît Charlot, Carole Chaix |
Mots clés
Mots clés contrôlés
Mots clés libres
Résumé
Les cytokines pro-inflammatoires sont des molécules impliquées dans de nombreuses pathologies (cancer, troubles dépressifs, CoViD-19, …) et présentes dans différents fluides biologiques (sang, sueur, salive, …). Le développement d’un biocapteur capable d’identifier et quantifier les cytokines dans ces différents fluides constituerait une stratégie très innovante dans le suivi des pathologies pro-inflammatoires. Dans ce contexte, l’objectif de cette thèse a été de développer un dispositif microfluidique intégrant des billes magnétiques fonctionnalisées pour la capture et la manipulation d’une cytokine modèle, le Tumor Necrosis Factor Alpha (TNF-α). Dans ce dispositif, les billes magnétiques fonctionnalisées avec des anticorps capturent le TNF-α au sein d’un circuit microfluidique et sont manipulées par des microbobines intégrées au dispositif. Une chambre fluidique de détection intégrant une surface biofonctionnalisée avec des anticorps anti-TNF-α permet l’immobilisation des immunocomplexes à base de TNF-α qui seront quantifiés par fluorescence. Dans un premier temps, un protocole de fonctionnalisation chimique du PDMS, matériau support du circuit microfluidique, a été développé et optimisé pour la réalisation de la chambre fluidique de détection. Cette fonctionnalisation par amino-silanisation a été caractérisée par différentes techniques physico-chimiques de surface : angle de contact, EDX, AFM, FTIR et microscopie à fluorescence. Les surfaces préparées ont été validées pour la détection par un immunodosage du TNF-α avec une limite de détection de 0.55 μg/mL (31.6 nM) en microscopie à fluorescence. L’intégration en microfluidique de ce procédé a ensuite consisté en un assemblage des surfaces silanisées avec un circuit microfluidique. Un protocole microfluidique de greffage des anticorps a été développé et a permis d’améliorer la qualité de la détection en termes de reproductibilité, rapidité et sensibilité avec une limite de détection de 0.22 µg/mL (12.64 nM) en fluorescence. Dans la deuxième partie de la thèse, l’utilisation de billes magnétiques comme vecteur de capture des cytokines a nécessité de choisir un modèle de billes en adéquation avec l’immunocapture du TNF-α. Dans cette optique, une méthode analytique a été développée par digestion enzymatique et chromatographie d’exclusion stérique (SEC) permettant de caractériser la qualité de l’immobilisation des anticorps à la surface (densité et orientation des anticorps). Parmi plusieurs modèles de billes (carboxyliques, tosylées, streptavidines et protéines G), les billes protéines G ont montré les meilleures performances avec plus de 70 000 anticorps immobilisés par bille dont 75% d’entre eux spécifiquement orientés pour une capture du TNF-α. Dans la dernière partie de la thèse, un dispositif de contrôle et de capture magnétique des billes protéine G a été élaboré à partir de microbobines de cuivre, encapsulées dans le circuit microfluidique. Celles-ci ont été fabriquées et caractérisées en salle blanche afin de générer un champ magnétique suffisant pour le blocage des billes tout en limitant les effets thermiques dus au courant injecté dans les bobines. La miniaturisation des bobines a permis leur intégration à proximité du circuit microfluidique générant un champ magnétique très localisé compatible avec les dimensions de la chambre de détection. Les dispositifs magnéto-fluidiques réalisés ont été évalués pour des premières expériences de fonctionnalisation des billes magnétiques protéine G par des anticorps fluorescents apportant ainsi la preuve de concept en vue de leur exploitation dans la détection intégrée des cytokines modèles (TNF-α).