Caractérisation d’un anticorps à domaine unique dirigé contre la protéine S et potentialisant son activité anticoagulante

Characterization of an anti-protein S single-domain antibody enhancing its anticoagulant activity

• Auteur / Autrice : Josepha Sedzro
• Direction : Delphine Borgel, François Saller
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Sciences pharmacologiques
• Date : Soutenance le 15/12/2021
• Etablissement(s) : université Paris-Saclay
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Innovation thérapeutique : du fondamental à l'appliqué
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Hémostase, inflammation, thrombose (Le Kremlin-Bicêtre, Val-de-Marne ; 2015-....)
• Partenaire(s) de recherche : référent : Université Paris-Saclay. Faculté de pharmacie (Orsay, Essonne ; 2020-....)
• Partenaire(s) de recherche : graduate school : Université Paris-Saclay. Graduate School Santé et médicament (2020-....)
• Jury : Président / Présidente : Philippe Nguyen
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Anne Angelillo-Scherrer, Isabelle Gouin-Thibault, Catherine Lemarie
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Anne Angelillo-Scherrer, Isabelle Gouin-Thibault

Mots clés

Mots clés contrôlés

Anticoagulants circulants

Anticorps à domaine unique

Thrombose

Hémostase

Mots clés libres

Hémostase

Thrombose

Anticorps à domaine unique

Anticoagulants circulants

Stratégies antithrombotiques

Anticorps thérapeutiques

Hemostatic proteins

Thrombosis

Single-Domain antibodies

Physiological anticoagulants

Antithrombotic strategies

Therapeutic antibodies

Résumé

La protéine S (PS) est une protéine vitamine K-dépendante qui limite la génération de thrombine à plusieurs niveaux de la coagulation. En effet, la PS joue un rôle bien connu de cofacteur de la protéine C activée (PCa), en stimulant son activité dans l’inactivation des facteurs Va (FVa) et VIIIa (FVIIIa). La PS est également un cofacteur de l’inhibiteur de la voie du facteur tissulaire (TFPIα) dans l’inhibition directe du facteur Xa. Cependant, l’importance relative de ces activités de la PS n’est pas connue in vivo. Afin de mieux comprendre les fonctions de la PS in vitro et in vivo, nous avons généré des nanobodies (anticorps à domaine unique produits chez les camélidés) dirigés contre la PS. Ces nanobodies ont été identifiés grâce à des stratégies variées de phage-display réalisées sur une banque immune obtenue à partir d’un lama immunisé avec de la PS recombinante humaine (rhPS). Parmi 14 nanobodies anti-PS identifiés (PS001 à PS014), le nanobody PS003 se liait fortement à la rhPS et présentait un effet de potentialisation tout à fait inattendu de l’activité cofacteur de la PCa de la PS, dans un test fonctionnel plasmatique. Nous avons donc choisi de caractériser ce nanobody plus en détail. Pour augmenter l’affinité du nanobody PS003 pour la PS, nous avons généré une forme bivalente du nanobody PS003 (PS003biv), mais seul un très faible gain d’affinité pour la rhPS, en ELISA, a été obtenu (constantes de dissociation apparentes de 26.8 ± 2.7 nM et 13.8 ± 5.7 nM pour PS003 et PS003biv, respectivement). En ELISA, les deux nanobodies reconnaissent le domaine SHBG isolé de la PS mais pas Gas6, qui est une protéine hautement homologue à PS et qui possède également un domaine SHBG. Ce résultat suggère donc que les nanobodies PS003 et PS003biv sont spécifiques de la PS. PS003 et PS003biv potentialisent tous deux l'activité cofacteur de la PCa de la PS (de 40 % et 80 % respectivement) dans un test de coagulation plasmatique, et de façon intéressante le nanobody PS003biv présente un effet de potentialisation plus important. Aucun effet de potentialisation de ces nanobodies n'a été observé sur l'activité de cofacteur du TFPIα de la PS en système purifié. Nous avons ensuite évalué le potentiel effet anti-thrombotique de PS003biv dans un modèle murin de thrombose induite par du chlorure de fer au niveau de la microcirculation du mésentère. L'injection de PS003biv (IV 10 mg/kg) a prolongé le temps d'occlusion dans les veinules mésentériques par rapport à un nanobody contrôle et semble induire la formation de thrombi instables et très susceptibles de former des emboles. De façon intéressante, dans un modèle de saignement de type « tail-clip », les souris injectées avec PS003biv (IV 10 mg/kg) ont un temps de saignement et un volume de sang perdu normaux, comparativement à des souris non injectées. En conclusion, le nanobody PS003biv potentialise l'activité cofacteur de la PS sur la PCa et présente un effet anti-thrombotique in vivo, sans affecter l'hémostase physiologique. Ainsi, l’augmentation de cette activité de la PS avec PS003biv pourrait constituer une stratégie thérapeutique anti-thrombotique originale. À l’heure actuelle, le mécanisme d’action des nanobodies PS003 et PS003biv reste inconnu, probablement complexe, et pourrait faire intervenir un autre partenaire de la PS que la PCa. En effet, nous n’avons pu retrouver l’effet de potentialisation de PS003 et PS003biv observé dans le test de coagulation plasmatique dans un test d’inactivation du FVa ou du FVIIIa par la PCa en présence de PS. Les travaux réalisés au cours de cette thèse apportent également une preuve de concept que des nanobodies anti-PS modulant l’activité anticoagulante de la PS peuvent être identifiés. Ces travaux pourraient ouvrir la voie à des stratégies de sélection par phage-display visant à identifier des nanobodies bloquant spécifiquement l’activité cofacteur de la PCa et du TFPIα.

Protein S (PS) is a vitamin K-dependent protein that limits thrombin generation at multiple levels of the coagulation cascade. Indeed, PS is well-known as a non-enzymatic cofactor for activated protein C (APC) in the proteolytic inactivation of factors Va (FVa) and VIIIa (FVIIIa). More recently, PS has also been described as a cofactor for the alpha isoform of tissue factor pathway inhibitor (TFPIα) in the direct inhibition of factor Xa (FXa). However, the relative importance of these anticoagulant activities of PS in vivo is not known. In order to better characterize the functions of PS in vitro and in vivo, we aimed at generating nanobodies (single-domain antibodies produced in camelids) targeting PS. These nanobodies were identified after various phage-display strategies using an immune library obtained from a llama immunized with recombinant human PS (rhPS). Among 14 anti-PS nanobodies identified to date (PS001 to PS014), PS003 nanobody was found to strongly bind to rhPS and to exhibit an unexpected enhancing effect on the APC-cofactor activity of rhPS in a plasma-based assay. We have therefore chosen to characterize this nanobody into more detail. To increase its affinity for PS, we generated a bivalent form of the PS003 nanobody (PS003biv), but this only led to a very slight increase in the affinity for rhPS in ELISA (apparent dissociation constants of 26.8 ± 2.7 nM and 13.8 ± 5.7 nM for PS003 and PS003biv, respectively). In ELISA, both nanobodies bound to the isolated SHBG domain of PS but not to Gas6, which is highly homologous to PS and also contains a SHBG domain. This suggested that PS003 and PS003biv were specific for PS. PS003 and PS003biv both increased the APC-cofactor activity of PS (of 40% and 80% respectively) in our plasma-based assay, and interestingly, PS003biv nanobody exhibits a greater enhancing effect than PS003. No enhancing effect of these nanobodies was observed on the TFPIα-cofactor activity of rhPS in purified systems. We then evaluated the anti-thrombotic potential of PS003biv in a ferric chloride-induced murine thrombosis model on mesenteric microvessels. The injection of PS003biv (IV 10 mg/kg) delayed occlusion time in mesenteric venules compared to a control nanobody and induced the formation of unstable thrombi that were prone to form emboli. Interestingly, in a tail-clip bleeding model, mice injected with PS003biv (IV 10 mg/kg) have normal bleeding times and blood loss volumes. In conclusion, our PS003biv nanobody enhanced the APC-cofactor activity of PS and exhibited an anti-thrombotic effect in vivo, without affecting physiological hemostasis. Thus, the enhancement of this anticoagulant activity of PS with PS003biv could constitute an original and safe anti-thrombotic therapeutic strategy. To date, the mechanism of action of PS003 and PS003biv nanobodies remains unknown and is probably complex. PS003biv might affect the interaction of PS with a yet unidentified partner other than APC, as we were unable to recapitulate the enhancing effect of PS003 and PS003biv observed in our plasma-based assay in a FVa or FVIIIa inactivation assay by APC in the presence of PS. This PhD work also provides a proof of concept that anti-PS nanobodies modulating the anticoagulant activity of PS can be identified. This work could pave the way for phage-display selection strategies aimed at identifying nanobodies that specifically inhibit the APC- or TFPIα- cofactor activity of PS.