Phosphorylation mitotique de la région N-terminale de la protéine BRCA2 par la kinase Plk1 : identification, caractérisation et rôle dans les interactions protéine-protéine

Plk1 mitotic phosphorylation in the N-terminal region of the BRCA2 protein : identification, characterization and role in protein interactions

• Auteur / Autrice : Manon Julien
• Direction : Sophie Zinn-Justin, François-Xavier Theillet
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biochimie et biologie structurale
• Date : Soutenance le 12/03/2021
• Etablissement(s) : université Paris-Saclay
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Innovation thérapeutique : du fondamental à l'appliqué (Châtenay-Malabry, Hauts-de-Seine ; 2015-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut de biologie intégrative de la cellule (Gif-Sur-Yvette, Essonne ; 2015-....)
• Partenaire(s) de recherche : référent : Université Paris-Saclay. Faculté de pharmacie (Orsay, Essonne ; 2020-....)
• Jury : Président / Présidente : Herman Van Tilbeurgh
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Isabelle Landrieu, Malene Jensen, Mauro Modesti
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Isabelle Landrieu, Malene Jensen

Mots clés

Mots clés contrôlés

Interactions protéine-protéine

Résonance magnétique nucléaire

Protéine BRCA2

Phosphorylation

Mots clés libres

Phosphorylation

Brca2

Plk1

Rmn

Interactions protéine-protéine

Phosphorylation

Brca2

Plk1

Nmr

Protein-Protein interactions

Résumé

BRCA2 est une oncoprotéine fréquemment mutée dans les cancers du sein héréditaires. Pour améliorer le diagnostic de ces cancers, plusieurs études moléculaires ont localisées des régions clés de BRCA2 et ont caractérisées l’impact de mutations sur les fonctions portées par ces régions. Ici, je m’intéresse à la région aa 48 à aa 284 (BRCA2₄₈₋₂₈₄) de la protéine. Cette région conservée est désordonnée (Julien et al. 2020 Biomol. NMR Assign), c.à.d. qu’elle ne contient pas de structure secondaire stable. Cette région est également phosphorylée par la kinase Plk1 à l’entrée en mitose. Cependant, des études précédentes utilisant la spectrométrie de masse n’ont pas permis d’identifier précisément les sites phosphorylés, limitant ainsi leur caractérisation fonctionnelle. Pour contourner ce problème, nous avons utilisé la RMN en temps réel pour identifier et caractériser les phosphorylations de BRCA2₄₈₋₂₈₄, à l’échelle du résidu. Nous avons développé deux protocoles permettant d’étudier la phosphorylation de régions désordonnées pour une grande gamme de pH et températures (Julien et al. 2020 Methods Mol. Biol; Alik et al. 2020 Angew. Chem.). Ainsi, nous avons identifié que Plk1 phosphoryle BRCA2₄₈₋₂₈₄ sur deux sites conservés : pS193 et pT207. Ceci. Nous a servi de base pour la caractérisation de ces sites. D’abord, nous avons identifié grâce à des méthodes biophysiques que BRCA2pT207 est un site d’interaction pour le domaine régulateur de Plk1. En collaboration avec l’équipe de Dr. Aura Carreira, nous avons montré que cette interaction est à la base d’un complexe quaternaire (BRCA2, Plk1, BubR1 et PP2A) qui régule l’alignement des chromosomes en métaphase (Ehlen et al. 2020. Nat Commun.). Nous avons aussi démontré que des mutations de BRCA2 issues de patientes ont un impact sur la phosphorylation de BRCA2 et la formation du complexe. Puis, nous avons réalisé des expériences de protéomique pour identifier de nouveau partenaires mitotiques reconnaissant pBRCA2₄₈₋₂₈₄. Nous avons identifié Plk1 et d’autres protéines impliquées dans la mitose. J’ai débuté l’analyse structurale de deux nouveaux partenaires prometteurs: Kif2C et Chk2. Nous avons aussi étudié le rôle de la préphosphorylation de BRCA2T77 par Cdk sur la phosphorylation par Plk1. Nous avons trouvé que BRCA2pT77 favorisait la phosphorylation de BRCA2S193 par Plk1. Enfin, nous avons initié une étude structurale sur la kinase Plk1, surexprimée dans de nombreux cancers dont le cancer du sein. Ici, j’ai produit plusieurs constructions de la kinase qui serviront à sa caractérisation structurale.

BRCA2 is an oncoprotein frequently mutated in hereditary breast cancers. To improve the diagnosis of these cancers, several molecular studies have identified BRCA2 key positions and characterized mutations in these regions causing a BRCA2 loss of function. However, these studies mainly focused on the C-terminal globular domain of BRCA2. Here, we characterized the N-terminal region of BRCA2 from aa 48 to aa 284 (BRCA2₄₈₋₂₈₄). This well-conserved region is disordered, i.e. it lacks stable secondary structure (Julien et al. 2020 Biomol. NMR Assign). It is also highly phosphorylated by the kinase Plk1 at the entry into mitosis. However, previous studies using mass spectrometry didn’t allow to precisely identify all the phosphorylation sites, limiting their characterization. To circumvent this problem, we used real-time NMR to monitor phosphorylations of the N-terminal region of BRCA2, at the residue level. We developed 2 protocols for disordered regions allowing phosphorylation in a large range of temperatures and pHs (Julien et al. 2020 Methods Mol. Biol; Alik et al. 2020 An- gew. Chem.). Then, we identified that Plk1 phosphorylates BRCA2 at 2 conserved positions: pS193 and pT207. We further searched for the function of these phosphoresidues. First, we identified by biophysical methods that BRCA2pT207 creates a docking site for the regulatory domain of Plk1. In collaboration with the group of Dr. Aura Carreira, we showed that this interaction contributes to the assembly of a quaternary complex involving BRCA2, Plk1, BubR1 and PP2A that regulates chromosome alignment in mitosis (Ehlen et al. 2020. Nat Commun.). We also demonstrated that breast cancer variants impact the phosphorylation of BRCA2 and the formation of the complex in vitro and in cell. Then, we per- formed proteomics experiments to identify new mitotic partners specific to phospho-BRCA2, and found Plk1 as well as other proteins involved in mitosis. I started the characterization of two new BRCA2 partners: Ki2C and Chk2. We also explored the role of Cdk1 phosphorylation of BRCA2T77 on further Plk1 phosphorylation. We found that early BRCA2T77 phosphorylation increases the phosphoryla- tion rate of BRCA2S193 by Plk1. Finally, we initiated a project about the Plk1 kinase, an interesting cancer-target as it is often overexpressed in several cancers, including breast cancers. Here, I produced several constructs of the kinase for further structural characterization.