La suppression de Topaz1 perturbe la méiose et l'expression des ARN non-codant longs testiculaires au cours de la spermatogenèse murine.

Suppression of Topaz1 Disrupts Meiosis and Expression of Testicular Long Non-Coding RNAs During Murine Spermatogenesis.

• Auteur / Autrice : Manon Chadourne
• Direction : Eric Pailhoux, Béatrice Mandon
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Aspects moléculaires et cellulaires de la biologie
• Date : Soutenance le 29/03/2021
• Etablissement(s) : université Paris-Saclay
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Signalisations et réseaux intégratifs en biologie (Le Kremlin-Bicêtre, Val-de-Marne ; 2015-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Biologie de la reproduction, environnement, épigénétique, et développement (Jouy-en-Josas,Yvelines ; 1995-....)
• Partenaire(s) de recherche : Référent : Université Paris-Saclay. Faculté de médecine (Le Kremlin-Bicêtre, Val-de-Marne ; 2020-....)
• Jury : Président / Présidente : Gabriel Livera
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Pascal Froment, Brigitte Boizet, Nadège Vernet
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Pascal Froment, Brigitte Boizet

Mots clés

Mots clés contrôlés

ARN long non codant

Infertilité masculine

Dissertation universitaire

Spermatogenèse

Numération des spermatozoïdes

Spermatozoïdes -- Motilité

Souris transgéniques

Recherche génétique

Mots clés libres

Topaz1

Cellules germinales

Fuseau de microtubule

Méiose

Spermatogenèse

Souris

Topaz1

Germ cells

Microtubule spindle

Meiosis

Spermatogenesis

Mouse

Résumé

Topaz1 (pour Testis and Ovary specific PAZ domain gene 1) est un gène très conservé chez les vertébrés qui présente une expression spécifique dans les cellules germinales. La caractérisation du modèle murin dépourvu du gène Topaz1 a mis en évidence son rôle indispensable pour la fertilité mâle. Les souris mutantes présentent un arrêt de la spermatogenèse lors de la première division méiotique. Les spermatocytes Topaz1-/- bloqués en fin de prophase I de méiose présentent un défaut d’alignement des chromosomes le long de la plaque métaphasique. D'un point de vue histologique, les différences observées entre les testicules de souris Topaz1-/- et Topaz1+/+ apparaissent entre 15 (P15) et 20 (P20) jours après la naissance. Une première analyse transcriptomique par puce à ADN a montré que 10% des gènes dérégulés (DEGs) à P20 sont des ARN non codants longs (lncRNAs). Au cours de cette thèse, des analyses transcriptomiques à haut débit (RNAseq) ont été réalisées à P16 et P18 afin de mieux caractériser le phénotype testiculaire des souris dépourvues du gène Topaz1. Dès P16, le transcriptome testiculaire est perturbé et le nombre de DEGs est multiplié par 10 à P18. Des gènes associés au centrosome, centriole, à la dynamique des microtubules et à la spermatogenèse appartiennent aux voies moléculaires les plus perturbées. De plus, un quart des DEGs sont des lncRNAs. Trois d'entre eux, dérégulés à P16 et à P18, ont été étudiés par hybridation in situ et biologie moléculaire et sont spécifiques des cellules germinales. Puis une lignée de souris exempt d'un de ces lncRNA a été générée grâce à la technologie CripsR/Cas9. Ces animaux mutants se développent normalement et sont fertiles pour les deux sexes.Néanmoins, les souris mâles mutantes présentent une diminution de plus de 50% de la concentration de spermatozoïdes épipidymaires ainsi qu’une modification de paramètres de motilité par rapport à des souris sauvages. Des nouvelles analyses RNAseq ont été réalisées afin d'étudier le transcriptome testiculaire de ces souris. Elles mettent en évidence que ce lncRNA régule un nombre important de gènes codants pour les protéines (environ 80% des DEGs à P18). Là encore, certains d'entre eux régulent la dynamique des microtubules, la spermatogenèse et la génération des gamètes haploïdes.En conclusion, le gène Topaz1 murin est donc essentiel pour la mise en place d’un fuseau bipolaire en fin de prophase I de méiose et son absence empêche la première division méiotique. La dérégulation d’un nombre important de gènes codants pour des protéines du centrosome, des microtubules et de la spermatogenèse ainsi que la forte répression de l'expression de lncRNAs au sein du testicule murin laisse à penser que des complexes ARNs-protéines se forment au cours de la méiose.Dans cette étude, la suppression d'un de ces lncRNA ne perturbe pas la fertilité des souris bien que la concentration spermatique soit réduire de moitié. Chez l'homme, une telle baisse pourrait conduire à des infertilités masculines. Une mutation du gène Topaz1 chez l'homme pourrait aussi induire une azoospermie non obstructive. L'étude des complexes ARN-protéines pourrait représenter un nouveau champ d’investigation dans l’étude des infertilités et notamment de la régulation de la méiose.

Topaz1 (Testis and Ovary specific PAZ domain gene 1), a germ cell specific factor, is a highly conserved gene in vertebrates. The study of the Topaz1-inactivation mouse model demonstrated its essential role for male fertility. The absence of Topaz1 in mutant mice caused spermatogenesis arrest during the first meiotic division. Topaz1-/- spermatocytes, blocked at the end of meiotic prophase I, showed chromosome misalignment along the metaphase I plate. Histological experiments specified that the differences observed between Topaz1-/- and Topaz1+/+ mouse testes appeared between 15 (P15) and 20 (P20) days post-partum. Previously, transcriptomic analyses using a whole-genome expression array indicated that 10% of P20-deregulated genes (DEGs) were long non-coding RNAs (lncRNAs). During this thesis, high throughput transcriptomic analyses (RNAseq) were performed at P16 and P18 in order to better characterise the testicular phenotype of mice lacking the Topaz1 gene. From P16, the testicular transcriptome was disturbed and the DEGs number was multiplied by 10 at P18. Genes associated with centrosome, centriole, microtubule dynamics and spermatogenesis belonged to the most disturbed molecular pathways. Moreover, a quarter of DEGs were lncRNAs. Three of them, deregulated at P16 and P18, were studied by in situ hybridization and molecular biology techniques. They were germ cell specific. Thus, a new mouse model deleted for one of these lncRNAs was generated using CRISPR/Cas9 technology. These mutant mice developed normally and were fertile in both sexes. However, mutant male mice presented a more than 50% decrease in the epididymal sperm concentration as well as a change in motility parameters compared to wild-type mice. New RNAseq analyses were realised to study testicular transcriptome of these mice. These showed that this lncRNA regulates a large number of protein-coding genes (approximately 80% of the DEGs at P18). There again, some of them regulated microtubule dynamics, spermatogenesis and haploid gamete generation.In conclusion, this work shows that the murine Topaz1 gene is therefore essential for the establishment of the bipolar spindle during the transition from late prophase I to metaphase I and its absence prevents the first meiotic division. The deregulation of a significant number of protein-coding genes of the centrosome, microtubule movements and spermatogenesis, as well as the strong repression of lncRNAs expression within mouse testis, suggests that RNAs-proteins complexes are formed during meiosis.In this study, deletion of one of these lncRNA did not affect fertility in mice even though sperm concentration was halved. In men, such a decrease could lead to male infertility. A mutation of the Topaz1 gene in men could also induce non-obstructive azoospermia. The study of RNAs-proteins complexes could represent a new field of investigation in the understanding of infertility, particularly in meiotic regulation.