Novel functional G-quadruplex ligands for cell imaging and genomic DNA covalent capture
Nouveaux ligands fonctionnels des G-quadruplexes pour l’imagerie cellulaire et la capture covalente d’ADN génomique
Résumé
G-quadruplexes (G4s) are non-canonical secondary structures that can be formed in G-rich DNA or RNA strands containing at least four repeats of two guanines. Today, these structures are known to regulate important biological processes such as replication, transcription and translation. Since their discovery, many small molecules (called G4 ligands) have been developed in the aim to selectively interact with these structures. However, G4 dynamic nature makes them difficult to study in cellular conditions. Therefore, it is still necessary to develop new molecular tools to study them in live cells. In this context, a new methodology called G4-GIS has been developed. This methodology allows to follow with higher resolution the localization of small molecules in cells and combines the advantages of using G4 ligands and immunofluorescence. For the development of this project, several derivatives of the known G-quadruplex ligand PDC were functionalized with a hapten (5-BrdU), which can be recognized by a specific antibody. At first, the synthesis focused on the functionalization of the PDC core with a linker bearing either an azide or an alkyne (PDC-Alk/N3). In parallel, the commercially available 5-BrdU was functionalized with an azide or alkyne group (5-BrdU-Alk/N3). The different PDC ligands were then tethered to the adapted 5-BrdU-Alk/N3 partners by a CuAAC reaction to form the 5BrdU functionalized PDC derivatives. This reaction can be performed in the presence of the G4 target (in situ functionalization), avoiding potential loss of affinity or selectivity due to the presence of the hapten. The different PDC derivatives, before and after functionalization, were then evaluated for their ability to bind G-quadruplex structures by two biophysical assays. Cell imaging of PDC-BrdU ligands was then performed by immunofluorescence staining. In addition, this method was performed after in situ functionalization of PDC-Alk/N3 ligands with 5-BrdU moiety. This G-quadruplex ligand immunodetection methodology allows to visualize with an excellent resolution the precise localization of G-quadruplex ligands in cells. Determining the exact localization of G-quadruplex structures throughout the genome is a major challenge for unravelling the biological roles of G-quadruplexes. For this purpose, a new method combining G4 photoaffinity labeling (PAL) and immunoprecipitation capture has been developed. PDC derivatives functionalized with both a photoactivatable moiety and a terminal alkyne were synthesized. The affinity and selectivity of these ligands towards G-quadruplex structures have been evaluated by two biophysical methods and the ability to selectively generate covalent bonds with G-quadruplex DNA after photo-irradiation was studied on different G4-forming sequences. In the next future, these G4 ligands will be employed in cells and, after immuno-tag (5BrdU) functionalization by CuAAC reaction, will be used to develop a chemical immunoprecipitation methodology. By using this approach, it will be possible to understand which G4s are really forming in a dynamic system and their accessibility by the ligands in order to clarify their roles associated with biological functions such as transcription.
Les G-quadruplexes (G4s) sont des structures secondaires non canoniques, pouvant être adoptées par des brins d’ADN ou d’ARN riches en guanines possédant au moins quatre répétitions de deux guanines. Ces structures sont aujourd’hui connues pour participer à la régulation de phénomènes biologiques comme la réplication, la transcription et la traduction. Depuis la découverte de ces structures, de nombreuses petites molécules (appelées ligands G4) ont été développées dans le but d’interagir sélectivement avec les G-quadruplexes. Cependant, le caractère très dynamique de ces structures en fait des cibles difficiles à étudier en conditions cellulaires. Il est donc nécessaire de développer des outils moléculaires permettant leur étude en cellules vivantes. Dans ce contexte, une nouvelle méthodologie, appelée G4-GIS a été développée. Cette méthodologie permet de suivre avec précision la localisation de petites molécules in cellulo et combine les avantages de l’utilisation de ligands avec l’immunofluorescence. Pour le développement de ce projet, plusieurs dérivés du ligand des G-quadruplexes PDC ont été fonctionnalisés avec un haptène (5-BrdU), pouvant être reconnu par un anticorps spécifique. La synthèse de ces dérivés implique tout d’abord la fonctionnalisation du PDC par un groupement azoture ou alcyne (PDC-Alk/N3). En parallèle, l’haptène commercial 5-BrdU a été fonctionnalisé par les mêmes groupements azoture ou alcyne (5-BrdU-Alk/N3). Les différents ligands PDC ont ensuite été couplés aux partenaires 5-BrdU-Alk/N3 adaptés par une réaction de CuAAC pour former les composés PDC-BrdU. Cette réaction peu, de plus, être réalisée in cellulo (fonctionnalisation in situ) dans le but d’éviter une potentielle perte d’affinité ou de sélectivité des ligands par la présence de la 5-BrdU. Les différents ligands avant et après fonctionnalisation ont ensuite été testés pour leur capacité à interagir avec les structures G-quadruplexes par deux méthodes biophysiques. L’imagerie cellulaire des ligands PDC-BrdU a ensuite été réalisée par immunofluorescence. De plus, l’immunodétection a pu être réalisée après fonctionnalisation in situ des ligands PDC-Alk/N3 avec la 5-BrdU. Cette méthodologie d’immunodétection de ligands des G-quadruplexes permet ainsi de détecter avec une excellente résolution la localisation de ligands des G-quadruplexes in cellulo. Déterminer la localisation exacte de formation de structures G-quadruplexes à travers le génome représente un réel défi et un enjeu majeur pour la compréhension des rôles biologiques des G-quadruplexes. Pour cela, une nouvelle méthode combinant le marquage par photoaffinité de G4s (PAL) avec l’immunoprécipitation a été développée. Des dérivés du ligand PDC fonctionnalisés à la fois par un groupement photoactivable et une fonction alcyne ont été synthétisés. L’affinité et la sélectivité de ces ligands pour les structures G-quadruplexes ont été évaluées par deux méthodes biophysiques sur différentes séquences G4s. Par ailleurs, la capacité des ligands à générer de façon sélective des liens covalents avec l’ADN G-quadruplex après photo-irradiation a été étudiée. Par la suite, ces molécules seront utilisées en cellules dans le but de réaliser l’immunoprécipitation de fragments d’ADN liés aux ligands après fonctionnalisation in situ avec la 5-BrdU par une réaction de CuAAC. Cette approche permettra de comprendre quelles séquences du génome forment des G4s ainsi que leur accessibilité par des ligands. Cette méthodologie permettra ainsi de clarifier les rôles biologiques associés à la formation de ces structures secondaires.
Origine : Version validée par le jury (STAR)