Thèse soutenue

Nouveaux ligands fonctionnels des G-quadruplexes pour l’imagerie cellulaire et la capture covalente d’ADN génomique
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Auteur / Autrice : Thibaut Masson
Direction : Marie-Paule Teulade-FichouDaniela Verga
Type : Thèse de doctorat
Discipline(s) : Chimie
Date : Soutenance le 13/12/2021
Etablissement(s) : université Paris-Saclay
Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Sciences chimiques : molécules, matériaux, instrumentation et biosystèmes
Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Chimie et modélisation pour la biologie du cancer (Orsay, Essonne ; 2015-....)
référent : Faculté des sciences d'Orsay
graduate school : Université Paris-Saclay. Graduate School Chimie (2020-....)
Jury : Président / Présidente : Boris Vauzeilles
Examinateurs / Examinatrices : Eric Defrancq, Maria Duca, Dominique Guianvarc'h, Anthony Bugaut, Marcel Hollenstein
Rapporteurs / Rapporteuses : Eric Defrancq, Maria Duca

Résumé

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Les G-quadruplexes (G4s) sont des structures secondaires non canoniques, pouvant être adoptées par des brins d’ADN ou d’ARN riches en guanines possédant au moins quatre répétitions de deux guanines. Ces structures sont aujourd’hui connues pour participer à la régulation de phénomènes biologiques comme la réplication, la transcription et la traduction. Depuis la découverte de ces structures, de nombreuses petites molécules (appelées ligands G4) ont été développées dans le but d’interagir sélectivement avec les G-quadruplexes. Cependant, le caractère très dynamique de ces structures en fait des cibles difficiles à étudier en conditions cellulaires. Il est donc nécessaire de développer des outils moléculaires permettant leur étude en cellules vivantes. Dans ce contexte, une nouvelle méthodologie, appelée G4-GIS a été développée. Cette méthodologie permet de suivre avec précision la localisation de petites molécules in cellulo et combine les avantages de l’utilisation de ligands avec l’immunofluorescence. Pour le développement de ce projet, plusieurs dérivés du ligand des G-quadruplexes PDC ont été fonctionnalisés avec un haptène (5-BrdU), pouvant être reconnu par un anticorps spécifique. La synthèse de ces dérivés implique tout d’abord la fonctionnalisation du PDC par un groupement azoture ou alcyne (PDC-Alk/N3). En parallèle, l’haptène commercial 5-BrdU a été fonctionnalisé par les mêmes groupements azoture ou alcyne (5-BrdU-Alk/N3). Les différents ligands PDC ont ensuite été couplés aux partenaires 5-BrdU-Alk/N3 adaptés par une réaction de CuAAC pour former les composés PDC-BrdU. Cette réaction peu, de plus, être réalisée in cellulo (fonctionnalisation in situ) dans le but d’éviter une potentielle perte d’affinité ou de sélectivité des ligands par la présence de la 5-BrdU. Les différents ligands avant et après fonctionnalisation ont ensuite été testés pour leur capacité à interagir avec les structures G-quadruplexes par deux méthodes biophysiques. L’imagerie cellulaire des ligands PDC-BrdU a ensuite été réalisée par immunofluorescence. De plus, l’immunodétection a pu être réalisée après fonctionnalisation in situ des ligands PDC-Alk/N3 avec la 5-BrdU. Cette méthodologie d’immunodétection de ligands des G-quadruplexes permet ainsi de détecter avec une excellente résolution la localisation de ligands des G-quadruplexes in cellulo. Déterminer la localisation exacte de formation de structures G-quadruplexes à travers le génome représente un réel défi et un enjeu majeur pour la compréhension des rôles biologiques des G-quadruplexes. Pour cela, une nouvelle méthode combinant le marquage par photoaffinité de G4s (PAL) avec l’immunoprécipitation a été développée. Des dérivés du ligand PDC fonctionnalisés à la fois par un groupement photoactivable et une fonction alcyne ont été synthétisés. L’affinité et la sélectivité de ces ligands pour les structures G-quadruplexes ont été évaluées par deux méthodes biophysiques sur différentes séquences G4s. Par ailleurs, la capacité des ligands à générer de façon sélective des liens covalents avec l’ADN G-quadruplex après photo-irradiation a été étudiée. Par la suite, ces molécules seront utilisées en cellules dans le but de réaliser l’immunoprécipitation de fragments d’ADN liés aux ligands après fonctionnalisation in situ avec la 5-BrdU par une réaction de CuAAC. Cette approche permettra de comprendre quelles séquences du génome forment des G4s ainsi que leur accessibilité par des ligands. Cette méthodologie permettra ainsi de clarifier les rôles biologiques associés à la formation de ces structures secondaires.