Détection et caractérisation des entérotoxines staphylococciques dans les aliments par couplage chromatographie liquide-spectrométrie de masse

Detection and characterization of staphylococcal enterotoxins in foods by liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry

• Auteur / Autrice : Donatien Lefebvre
• Direction : François Becher, Yacine Nia
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Chimie
• Date : Soutenance le 07/12/2021
• Etablissement(s) : université Paris-Saclay
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Sciences chimiques : molécules, matériaux, instrumentation et biosystèmes (Orsay, Essonne ; 2015-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Médicaments et technologies pour la santé (Gif-sur-Yvette, Essonne ; 2020-....) - Laboratoire de sécurité des aliments de Maisons-Alfort et de Boulogne-sur-Mer
• Partenaire(s) de recherche : référent : Faculté des sciences d'Orsay
• Partenaire(s) de recherche : graduate school : Université Paris-Saclay. Graduate School Chimie (2020-....)
• Jury : Président / Présidente : Guillaume Van der Rest
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Laurence Sabatier, Yves Le Loir, Julien Masquelier
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Laurence Sabatier, Yves Le Loir

Mots clés

Mots clés contrôlés

Immunocapture

Protéomique

Spectrométrie de masse

Entérotoxines

Mots clés libres

Entérotoxines staphylococciques

Spectrométrie de masse

Immunocapture

Staphylococcal enterotoxins

Mass spectrometry

Immunocapture

Résumé

Les toxi-infections alimentaires collectives (TIAC) à staphylocoques sont causées par l'ingestion d’aliments contaminés par des entérotoxines staphylococciques (ES), produites par certaines souches de staphylocoques à coagulase positive. À ce jour, 35 ES sont décrites dans la littérature (SEA à SEl33) mais seules cinq types, SEA à SEE, sont détectables en routine via la norme EN ISO 19020 ou via des techniques ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) car des anticorps spécifiques ne sont pas disponibles pour l’ensemble des ES. Lors d’épisodes de TIAC, il arrive régulièrement qu’aucune ES de type SEA-SEE ne soit retrouvée alors qu’une symptomatologie typique d’intoxication à staphylocoques a été identifiée. De plus, les données épidémiologiques soulignent la présence fréquente d’autres gènes types seg, seh et sei dans des souches de S. aureus issus de TIAC. Il est donc impératif de disposer d’outils d’analyse et de confirmation capables de viser une large gamme d’ES. La spectrométrie de masse (SM) apporte une grande spécificité d’analyse au sein de milieux complexes et une capacité élevée de multiplexage des analyses. D’autre part, elle ne nécessite pas obligatoirement la production d’anticorps spécifiques de chaque ES (sauf formats particuliers, type immunocapture). Ainsi, la SM apparaît comme une alternative pertinente, particulièrement pour la détection des ES connues ou récemment décrites pour lesquelles il n’existe pas d’anticorps spécifiques. Lors de cette thèse, une méthode par SM a tout d’abord été développée pour la quantification et la caractérisation des huit premières ES (SEA-SEE et SEG-SEI) en matrice alimentaire. Cette méthode utilise l’approche analytique la plus sensible d’après la littérature, c.a.d. une extraction des ES par immunocapture (anticorps commerciaux ou produits au CEA) suivie d’une digestion trypsique (bottom-up). La spécificité de notre méthode a permis de détecter les huit ES dans des matrices alimentaires, et nous avons pu atteindre une limite de détection comprise entre 0,1 et 0,5 ng/g. Ces concentrations correspondent aux concentrations retrouvées lors des investigations d’épisodes de TIACs. Cette méthode LCMS a été appliquée avec succès à des matrices variées issues de TIACs, donnant des résultats concordants avec les tests ELISA disponibles et les analyses PCR (Polymerase Chain Reaction). En parallèle, et de manière à mieux discriminer les variants de séquence, une quantification par approche top-down (analyse de protéine intacte) a été développée. L’analyse top-down permet une analyse globale de la séquence de l’ES ciblée à l’inverse du mode bottom up qui ne détecte que certains peptides. Une optimisation des paramètres SM et du traitement des données a été réalisée et un étalon interne a été sélectionné. Cela nous a permis d’obtenir, pour la SEA, une méthode de quantification absolue avec une sensibilité proche de la technique bottom-up. La méthode a finalement été confrontée à des analyses génomiques et ELISA lors de l’analyse de 13 souches productrices de variants de SEA. Enfin, nous avons souhaité élargir la quantification des ES au-delà des huit premières. Ainsi nous avons optimisé une méthode de préparation de l’échantillon sans anticorps. La méthode a été appliquée à des ES produites par des souches de S. aureus en milieu de culture. Nous avons pu identifier pour la première fois 24 types d’ES et plus de 162 variants. Des peptides spécifiques à chaque type et commun à l’ensemble des variants ont pu être identifiés. Par la suite, une méthode de quantification « label free » a été proposée, basée sur le principe « Hi3 » où le signal des trois peptides les plus intenses de chaque ES est exploité. A l’aide de cette méthode, nous avons pu identifier les ESs produites en forte quantité et établir leur cinétique de production par le S. aureus en milieu de culture, donnant de nouvelles indications sur les ES à rechercher en priorité lors d’épisodes de TIAC.

Staphylococcal food poisoning outbreaks (SFPO) are caused by the ingestion of food contaminated with staphylococcal enterotoxins (SE), produced by certain strains of coagulase-positive staphylococci. To date, 35 SE are described in the literature (SEA to SEl33) but only five types, SEA to SEE, are routinely detectable via the EN ISO 19020 standard or ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) techniques because specific antibodies are not available for all SE. During an SFPO, it regularly happens that no SEA-SEE type SE is found even though a typical symptomatology of staphylococcal poisoning has been identified. In addition, epidemiological data highlight the frequent presence of other seg, seh and sei type genes in S. aureus strains derived from SFPO. It is therefore necessary to develop analytical and confirmatory tools targeting a wide range of SE. Mass spectrometry (MS) provides a high specificity in complex media and ability for multiplex analyses. Moreover, it does not necessarily requires the production of specific antibodies for each SE (except for particular formats, such as immunocapture). Thus, MS appears to be a relevant alternative, particularly for the detection of known or recently described SE for which no specific antibodies exist.During this doctoral thesis, a very sensitive MS method was developed first for the quantification and characterization of the first eight SE (SEA-SEE and SEG-SEI) in food matrix. This method uses an extraction step of SE by immunocapture (commercial or CEA antibodies) followed by a trypsin digestion (bottom-up). The specificity of our method allowed the detection of all eight SE in food matrices. This method was optimized to reach a limit of detection between 0.1 and 0.5 ng/g. These concentrations correspond to the concentrations found during SFPO episodes. This MS method was successfully applied to a variety of SFPO matrices, giving results consistent with available ELISA and PCR (Polymerase Chain Reaction) tests. In the meantime, in order to obtain more information on variants and their sequence, a top-down analysis (intact protein) was developed. The top-down analysis allows a global analysis of the sequence of the targeted SE as opposed to the bottom-up mode which only detects certain peptides. An optimization of MS parameters and data processing was performed and an internal standard was selected. This allowed us to obtain an absolute quantification method for SEA with a sensitivity close to the bottom-up technique. To illustrate the interest of this new method, it was applied to 13 SEA variant-producing strains, in parallel with genomic analyses. Finally, we decided to extend the quantification beyond the first eight SE. Thus, we optimized a sample preparation method that does not use antibodies. The method was applied to SE produced by S. aureus strains in culture medium. We were able to identify 24 SE types and more than 162 variants for the first time. Peptides specific of each type and common to all variants were identified. Subsequently, a "label free" quantification method was proposed, based on the "Hi3" protocol, which consists in using the three most intense peptides of each SE for the quantification. By using this method, we were able to identify the ES produced in high quantity and to establish their kinetics of production by S. aureus in culture medium, giving new indications on the priority SE during SFPO.