Effects of gamma irradiation-induced reactive oxygen species on phagocytes NADPH oxidase

par Stephenson Boakye Owusu

Thèse de doctorat en Chimie

Sous la direction de Laura Baciou et de Kwasi Preko.

Le président du jury était Mehran Mostafavi.

Le jury était composé de Mariano Ostuni, Pham My-Chan Dang, Corinne Dupuy, Francis Hasford, Augustine Faanu.

Les rapporteurs étaient Mariano Ostuni, Pham My-Chan Dang.

  • Titre traduit

    Effets des espèces réactives de l'oxygène induits par l'irradiation gamma sur la NADPH oxydase des phagocytes


  • Résumé

    Les neutrophiles jouent un rôle très important dans la défense immunitaire humaine contre les infections pathogènes. Les acteurs prédominants dans ce rôle lors de l'activation des neutrophiles sont la libération d'agents cytotoxiques stockés dans les granules et les vésicules sécrétoires, et la production d'espèces réactives de l'oxygène (ROS) initiée par une enzyme NADPH oxydase. La NADPH oxydase est organisée comme un complexe de protéines membranaires et cytosoliques à l'état actif. Il est constitué d’un flavocytochrome b₅₅₈ membranaire (cytb₅₅₈) qui comprend deux sous-unités, gp91phox et p22phox; et quatre composants cytosoliques: p47phox, p67phox, p40phox et Rac. Le dysfonctionnement de l'un des composants du complexe conduit à la maladie granulomateuse septique chronique (CGD) qui rend les patients très vulnérables aux infections. L'hyper-activation de la NADPH oxydase conduit à un stress oxydatif qui entraîne des maladies dégénératives et cardiovasculaires. Ainsi, l'activité de la NADPH oxydase doit être régulée. Le but de cette thèse était d'étudier l'impact du stress oxydatif sur les neutrophiles humains et en particulier sur la NADPH oxydase. Dans ce travail, le stress oxydatif sur les neutrophiles, isolés à partir sang de donneur sain humain, a été simulé en utilisant l’irradiation gamma ⁶⁰Co qui conduit en solution à la présence d’O₂•⁻, OH• et H₂O₂, de manière similaire au stress oxydatif. Les résultats ont montré que le stress oxydatif mimé par une irradiation de 25 Gy (8.5 µM O₂•⁻ et 6.75 µM OH•) et de 50 Gy (17 µM O₂•⁻ et 13.5 OH•), pré-active l’enzyme NADPH oxydase. Cette pré-activation comprend i) une localisation accrue du cytb₅₅₈ au niveau de la membrane plasmique, ii) une phosphorylation partielle de p47phox (sur la sérine 345) iii) le recrutement des protéines cytosoliques (sauf RAC) à la membrane, ce qui a abouti à iv) une petite mais détectable augmentation de la production de ROS. De plus, un faible niveau de stress oxydatif mimé par une irradiation de 0.2 Gy (0.07 µM O₂•⁻ et 0.06 µM of OH•) et de 2 Gy (0.68 µM O₂•⁻ et 0.56 µM of OH•) sur des lignées de cellules PLB différenciées en neutrophiles a également révélé une présence accrue de cytb₅₅₈ au niveau de la membrane plasmique. En général, notre analyse a montré une forte corrélation entre le fonctionnement de la NADPH oxydase et l'augmentation du niveau de stress oxydatif. Enfin, un niveau de stress oxydatif très élevé (135 Gy correspondant à 45.9 µM et 37.8 µM of OH•) a révélé une forte présence de cytochrome c associé à la membrane plasmique en défaveur du cytb₅₅₈. Ce résultat est surprenant car le cytochrome c est presque totalement absent dans les neutrophiles. Considéré comme l'un des principaux acteurs apoptotiques, le cytochrome c est libéré des mitochondries, peu présentes dans le neutrophiles, lors d’un processus apoptotique. Cette découverte met en évidence l'importance des mitochondries dans le mécanisme de mort des cellules neutrophiles, rôle qui comme par le passé, a induit en erreur. Nos résultats suggèrent que le stress oxydatif est probablement un activateur potentiel de la NADPH oxydase des neutrophiles et pourrait jouer un rôle dans la thérapeutique et dans la pathogenèse des maladies associées.


  • Résumé

    Neutrophils play a very key role in the human immune defence against pathogenic infections. The predominant players in this role during activation of neutrophils are the release of cytotoxic agents stored in the granules and secretory vesicles, and the production of reactive oxygen species (ROS) initiated by an enzyme NADPH oxidase. NADPH oxidase is organized as a complex of membrane and cytosolic proteins in the active state. It constitutes a membrane-bound flavocytochrome b₅₅₈ (cytb₅₅₈) which comprises two subunit, gp91phox and p22phox; and four cytosolic components: p47phox, p67phox, p40phox and Rac. Dysfunction in any of NADPH oxidase components leads to chronic granulomatous disease (CGD), a condition which makes patients susceptible to infections. Hyper-activation of NADPH oxidase leads to oxidative stress which implicates in degenerative and cardiovascular disease. Thus, NADPH oxidase activity must be tightly regulated. The aim of this thesis was to investigate the impact of oxidative stress on human neutrophils. The major focus was on NADPH oxidase at the molecular and cellular levels. In this work, oxidative stress on neutrophils, isolated from human blood, was mimicked using ⁶⁰Co gamma irradiation (leading to O₂•⁻, OH• and H₂O₂ in water solution) and the effects were studied. The results showed that oxidative stress, mimicked by 25 Gy (8.5 µM O₂•⁻ and 6.75 µM OH•) and 50 Gy (17 µM O₂•⁻ and 13.5 OH•), of gamma irradiation pre-activated neutrophil NADPH oxidase. This pre-activation comprised i) increased cytb₅₅₈ localization at the plasma membrane, ii) partial phosphorylation of p47 phox (on serine 345) iii) recruitment of NADPH oxidase cytosolic proteins (except RAC) to the membrane, which resulted in iv) small but detectable increased ROS production. Furthermore, low level of oxidative stress mimicked by 0.2 Gy (0.07 µM O₂•⁻ and 0.06 µM of OH•) and 2 Gy (0.68 µM O₂•⁻ and 0.56 µM of OH•) of irradiation on PLB-cell lines differentiated into neutrophils also revealed an increased cytb₅₅₈ at the plasma membrane. In general, our analysis showed a strong correlation between the pre-activation of NADPH oxidase and an increase in the level of oxidative stress. Finally, a test on a very high level of oxidative stress mimicked by 135 Gy (45.9 µM and 37.8 µM of OH•) revealed a strong presence of cytochrome c in association with the plasma membrane in disfavour of cytb₅₅₈. This result was surprising since cytochrome c is almost completely absent in human neutrophils. Believed to be one of the principal apoptotic players, cytochrome c is released from mitochondria upon an apoptotic insult. This discovery highlights the importance of mitochondria in the death mechanism of neutrophil cells, role that as in the past misleading. Our results suggest that oxidative stress is likely a potential activator of neutrophil NADPH oxidase and may play a role in therapeutics and in pathogenesis of related diseases.



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