Identification de facteurs impliqués dans la réponse au stress réplicatif chez Arabidopsis thaliana

Understanding and exploring players in plants' replicative stress response

• Auteur / Autrice : Maherun Nisa
• Direction : Cécile Raynaud
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie
• Date : Soutenance le 19/11/2021
• Etablissement(s) : université Paris-Saclay
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Sciences du végétal : du gène à l'écosystème (Orsay, Essonne ; 2015-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut des sciences des plantes de Paris-Saclay (Gif-sur-Yvette, Essonne ; 2015-....)
• Partenaire(s) de recherche : Référent : Faculté des sciences d'Orsay
• Partenaire(s) de recherche : graduate school : Université Paris-Saclay. Graduate School Biosphera (2020-….)
• Jury : Président / Présidente : Florian Frugier
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Charles White, Judit Szecsi, Sandra Noir
• Jury : Rapporteur / Rapporteuse : Charles White, Judit Szecsi

Mots clés

Mots clés contrôlés

ADN -- Réparation

Méristèmes

Cycle cellulaire végétal

ADN -- Réplication

Mots clés libres

Cycle cellulaire

Méristèmes

Stress réplicatif

Lésions de l'ADN

Cell cycle

Meristem

Replicative stress

DNA damage

Résumé

Le maintien de l’intégrité du génome est essentiel à la survie de tous les êtres vivants. Les voies de signalisation permettant la détection et la réparation de ces lésions (appelées DNA Damage Response, DDR) sont en grande partie conservées entre les plantes et les animaux, bien qu’il existe des spécificités propres aux cellules végétales. Ainsi, l’intégrateur central de la DDR chez les plantes est le facteur de transcription SOG1, qui n’a pas d’homologue chez les animaux. Diverses études indiquent cependant qu’il existe des voies de la DDR indépendantes de SOG1, notamment lors de la réponse au stress réplicatif. Le stress réplicatif, qui est induit lorsque la progression de la fourche de réplication est perturbée, est une source majeure de dommages de l’ADN, car il survient dans toutes les cellules en prolifération. Au cours de ma thèse, j’ai étudié comment les cellules de plantes répondent au stress réplicatif (i) en tentant d’identifier de nouveaux acteurs de cette réponse, et (ii) en explorant les mécanismes impliqués dans la réparation des lésions associées à la réplication. Pour le premier objectif, j’ai combiné des approches de génétique inverse et directe. Par génétique inverse, j’ai étudié la contribution des facteurs de transcription E2F. Ces facteurs sont bien connus pour leur rôle dans le contrôle de la transition G1/S du cycle cellulaire, et l’un d’eux, E2Fa, avait récemment été identifié comme un acteur important de la réponse aux cassures double-brin. Afin de tester son implication, ainsi que celle de son plus proche homologue, E2Fb, dans la réponse au stress réplicatif, j’ai utilisé le mutant pol2a, déficient pour une ADN polymérase réplicatif, dont l’équipe d’accueil a montré qu’il présente un stress réplicatif constitutif. J’ai ainsi pu montrer que E2Fb, fonctionne probablement en parallèle de SOG1 pour réguler la réponse au stress réplicatif. En parallèle, afin d’identifier de nouveaux acteurs de la réponse au stress réplicatif, j’ai participé à un crible génétique que l’équipe d’accueil avait initié avant mon arrivée. Afin d’identifier des suppresseurs du mutant pol2a. J’ai cartographié par séquençage la mutation présente dans l’un de ces suppresseurs, et ainsi identifié le facteur de transcription LUMINIDEPENDENS (LD) comme un nouvel acteur de la DDR. La caractérisation détaillée de ce facteur est encore en cours, et se poursuivra au-delà de la fin de ma thèse. Enfin, pour mieux comprendre comment les cellules végétales répondent aux lésions de l’ADN associées à la réplication, j’ai étudié le rôle d’une ADN polymérase non-réplicative : l’ADN polymérase theta (Polθ). Elle est impliquée dans la TLS (trans-lesion synthesis) pendant la réplication, et dans la réparation des cassures double-brin. Chez Arabidopsis, le mutant tebichi (teb), déficient pour la Polθ, avait été décrit comme présentant de sévères défauts de développement, ce qui suggérait que cette voie de réparation était indispensable au développement des plantes, mais des études plus récentes avaient remis en cause ce résultat. J’ai pu montrer que le mutant teb présente en réalité un phénotype très variable, avec un mélange de plantes d’aspect identique à celui de plantes sauvages, et de plantes dont le développement est fortement altéré. Grâce à l’étude de l’interaction génétique entre les mutations teb et pol2a, nous avons pu montrer que la Polθ est indispensable à la réparation des lésions associées à la réplication de l’ADN. De plus, nous avons montré que la proportion de mutants teb présentant un phénotype anormal augmente lorsque les plantes sont exposées à divers stress abiotiques, ce qui suggère que les stress environnementaux ont un impact sur l’intensité du stress réplicatif dans les cellules végétales, et indique les voies de la DDR jouent probablement un rôle important dans la capacité des plantes à faire face aux fluctuations de leur environnement.

Survival of living organism is fully dependent on the maintenance of genome integrity. Due to their sessile lifestyle, plants are constantly exposed to biotic and abiotic stresses that could lead to DNA damage. Studies show that compared to animals, plants have both shared and unique mechanisms that control the DNA Damage Responses (DDR). One central integrator of the plant DDR is the SOG1 transcription factor, but there is accumulating evidence that other pathways function independently of SOG1, notably in the context of replicative stress. Replicative stress is one of the most common threats to genome integrity as it occurs in all proliferating cells. During my PhD I studied how plant cells respond to replicative stress (i) to identify new players in the signaling of replicative stress, and (ii) to explore the cellular pathways allowing plant cells to deal with replicative stress, and repair replication-associated DNA damage. For the first objective, I combined forward and reverse genetic approaches. Through reverse genetics, I studied the contribution of E2F transcription factors in plant’s replicative stress response. Already E2F are well characterized for their role at the G1/S transition, and one of them, EF2a had been recently shown to contribute to the cellular response to double strand breaks. In order to test the involvement of E2Fs in replicative stress response in plants, we used genetic approaches, taking advantage of the pol2a mutant that is deficient for a replicative DNA polymerase and displays constitutive replicative stress. Our results indicate that E2Fb may function in parallel of SOG1 in replicative stress response, providing evidence for the existence of a novel pathway in plants’ DDR signaling. In parallel, to discover new players in the plant replicative stress response, I contributed to a forward genetic screen that my host lab had initiated. They took advantage of the pol2a mutant. Seeds of a pol2a mutant expressing the b-glucuronidase under the control of the promoter of the DNA Damage marker gene CYCB1; 1 were mutagenized with EMS. The M2 generation has been screened for suppressors that show restored growth and reduced expression of the CYCB1; 1 reporter gene. From one suppressor, I successfully mapped by sequencing the causal mutation and found it affected the LD (LUMINI-DEPENDENS) gene, encoding a homeobox transcription factor. The detailed characterization of LD and its involvement in replicative stress response is still ongoing, and will extend beyond the completion of my PhD. Finally, to investigate how plant cells deal with replication-associated DNA damage, we studied the plant’s non replicative DNA polymerase theta (Polθ). This polymerase is involved in trans-lesion synthesis during DNA replication and double-strand break (DSB) repair through Alternative Non-Homologous End Joining (Alt-NHEJ). The Arabidopsis tebichi (teb) mutants, deficient in Polθ, had been reported to display severe developmental defects, leading to the conclusion that Pol θ is required for normal plant development. However, this essential role of Pol θ in plants was later challenged by contradictory reports regarding the phenotypic defects of Arabidopsis teb mutants and the recent finding that rice (Oryza sativa) null mutants develop normally. We showed that the phenotype of teb mutants is actually highly variable. Taking advantage of hypomorphic mutants for the replicative DNA polymerase epsilon (pol2a), we could show that Pol θ allows maintenance of meristem activity when DNA replication is partially compromised. Furthermore, we found that the phenotype of Pol θ mutants can be aggravated by modifying their growth conditions, suggesting that environmental conditions impact the basal level of replicative stress and providing evidence for a link between plants’ responses to adverse conditions and mechanisms involved in the maintenance of genome integrity.